高效液相色谱法测定复方氯唑沙宗片中两组分血药浓度

【摘要】目的：研究建立测定血浆中复方氯唑沙宗片两组分浓度的HPLC-UV法。方法：反相高效液相色谱法测定血浆中药物的浓度。Zorbax XDB-C18色谱柱，血浆样品经乙醚提取，空气吹干，加流动相溶解进样。氯唑沙宗的流动相为甲醇∶水=(60∶40)，在波长282 nm处检测；对乙酰氨基酚的流动相为甲醇∶水=(20∶80)，在波长245 nm处检测，以外标法计算。结果：氯唑沙宗在0.208～33.28 μg/ml、对乙酰氨基酚在0.238～14.28 μg/ml浓度范围内，样品的峰面积与对应浓度呈良好线性关系，r氯=0.9998，r对= 0.9998。最低检测限均为0.1 μg/ml， 氯唑沙宗高、中、低（20.8 μg/ml，4.16 μg/ml，0.416 μg/ml）3种浓度的方法回收率分别为(103.36±6.0)%，(99.51±1.2)%，(99.08±1.88)%；对乙酰氨基酚高、中、低（9.52 μg/ml，2.38 μg/ml，0.476 μg/ml）3种浓度的方法回收率依次为(101.5±3.15)%，(97.6±1.93)%，(99±3.15)%，日内RSD分别为（1.2%~2.3%）、（1.4%~6.7%），日间RSD分别为（2.5%~5.1%）、（5%~7.8%）。结论：此法操作简便、结果可靠。

【关键词】血药浓度；高效液相色谱法；氯唑沙宗；对乙酰氨基酚

文章编号：1009-5519（2007）19-2856-02 中图分类号：R9 文献标识码：A

Determination of two component concentrations of complex chlorzoxazone tablets in human serum by HPLC

LIANG Nan1， JIANG Yun-ping2，WU Dong2

(1.Chengdu Medical College，Sichuan 610083，China；2.Department of Pharmacy，General Hospital of Chengdu Military Region，Chengdu 610083，China)

【Abstract】Objective:To establish a HPLC method for the determination of two component concentrations of complex chlorzoxazone tablets in human serum.Methods：The serum samples were extracted with ether，dried with gas，dissolved in mobile phase and determined with HPLC. The Zorbax XDB-C18 column was used. The mobile phase consisted of methanol∶water (60∶40)or methanol∶water(20∶80) respectively. It was detected at 282 nm or 245nmrespectively.Results：A linearity was obtained from 0.208 to 33.28 μg/ml of chlorzoxazone (r=0.9998) and from 0.238 to 14.28 μg/ml of acetaminophen (r = 0.9998)respectively. The limit of detection was 0.1 μg/ml. Their average recoveries were 95.3% and 99.4% respectively. The precision(RSD) was 6.0% and 2.4% respectively. Conclusion：This study provided a simple and reliable assay which can be used todetermine two component concentrations of complex chlorzoxazone tablets in human serum.

【Key words】Serum medicinal；HPLC；Chlorzoxazone；Acetaminophen

复方氯唑沙宗片是中枢性骨骼肌松弛剂氯唑沙宗和抗炎镇痛药对乙酰氨基酚组成的复方制剂。临床主要用于各种急、慢性软组织挫伤所引起的疼痛及肩周炎、关节炎、肌炎、肌纤维炎等症，已取得良好效果。氯唑沙宗和对乙酰氨基酚在镇痛方面的协同作用，比单方氯唑沙宗疗效更显著， 对乙酰氨基酚（扑热息痛）是乙酰苯胺类解热镇痛药，不良反应小，而其疗效和毒性与血药浓度密切相关，故建立快速、灵敏和准确的血药浓度分析方法是非常必要的。为此，我们参考有关资料[1～5]建立了分别测定氯唑沙宗、对乙酰氨基酚两组分在血浆中浓度的方法，方法专一性强，快速准确，回收率较高，日内日间变异小，血浆中杂峰不干扰测定，为人体血药浓度监测及生物利用度研究提供了可靠方法和依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与色谱条件：HP1100型高效液相色谱仪：G1311A QuatPump，G1313A ALS，G1315A DAD，HP ChemStation Plus。Zorbax XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；氯唑沙宗的流动相为甲醇∶水=60∶40，流速为1 ml/min，检测波长为282 nm，柱温:20℃；对乙酰氨基酚的流动相为甲醇∶水=20∶80，流速为1 ml/min，检测波长为245 nm，柱温20℃。

1.2 药品与试剂：复方氯唑沙宗片，氯唑沙宗对照品(＞99%) 、对乙酰氨基酚对照品(＞99%)， 均由山东鲁南贝特制药有限公司提供;甲醇(色谱纯)；重蒸馏水；其它试剂均为AR级。

1.3 贮备液：精密氯唑沙宗对照品和对乙酰氨基酚对照品适量，分别配制成8.32 μg/ml、83.2 μg/ml、416 μg/ml和9.52 μg/ml、95.2 μg/ml、476 μg/ml的甲醇溶液，将容量瓶盖拧紧，保鲜膜封住瓶塞，放入4~10 ℃冰箱冷藏保存。

1.4 样品处理

1.4.1 血浆样本：精密吸取血浆1 ml置10 ml具塞塑料试管中，加入乙醚5 ml，涡旋混匀1分钟后， 离心10 min(2500 r/min)。精密吸取上清液3 ml于50 ℃空气吹干，冷却至室温，溶于200 μl流动相中，涡旋离心10 min(2500 r/min)，进样10 μl。

1.4.2 标准曲线的制备：精密吸取空白血浆1 ml，分别配制成浓度为0.208，0.416，1.664，4.16，8.32，20.8，33.28 μg/ml的氯唑沙宗片血浆标准系列和浓度为0.238，0.476，1.428，2.38，4.76，

9.52，14.28 μg/ml的对乙酰氨基酚血浆标准系列。其余操作同血浆样本处理过程。分别以氯唑沙宗、对乙酰氨基酚浓度对样品峰面积作直线回归方程。

1.4.3 精密度与回收率测定：精密吸取两种标准溶液分别加入1ml血浆中，氯唑沙宗浓度为高、中、低（20.8 μg/ml，4.16 μg/ml，0.416 μg/ml）和对乙酰氨基酚浓度为高、中、低（9.52 μg/ml，2.38 μg/ml，0.476 μg/ml）浓度。按（1.4.1）血浆样本方法处理后分析，分别测定3种浓度的血样，每天平行测定5次（日内），连续测定5天（日间）。

2 结果

2.1 色谱行为：选用282 nm作为检测波长时，在选定的氯唑沙宗色谱条件下，对照品基线平稳，空白血浆层析图谱中对应氯唑沙宗的保留时间4.394分钟处无峰出现，主峰与各杂质峰分离良好。见图1。 br>

选用24 5nm作为检测波长时，在选定的对乙酰氨基酚色谱条件下，对照品基线平稳，空白血浆层析图谱中对应对乙酰氨基酚的保留时间3.851min处无峰出现， 主峰与各杂质峰分离良好，见图2。

2.2 线性关系和灵敏度：血浆中氯唑沙宗在0.208～33.28 μg/ml，对乙酰氨基酚在0.238～14.28 μg/ml 浓度范围内呈良好线性关系。回归方程分别为C氯=-0.0576+4.0328A，r=0.9998；C对=0.0176A+ 0.0256，r=0.9998。最低检测限均为0.1 μg/ml。（S/N=3）

2.3 精密度试验：其高、中、低3种浓度的精密度试验结果见表1。

2.4 回收率试验：取已知含氯唑沙宗为0.416 μg/ml，4.16 μg/ml，20.8 μg/ml和对乙酰氨基酚0.476 μg/ml，2.38 μg/ml，9.52 μg/ml浓度的血浆样品，按血样项下操作，测定含量(n=5)，计算方法回收率，氯唑沙宗分别为(103.36±6.0)%，(99.51±1.2)%，(99.08±1.88)%， 对乙酰氨基酚分别为(101.5±3.15)%，( 97.6±1.93)%，( 99%±3.15)%。

3 讨论

3.1 本实验中，因氯唑沙宗和对乙酰氨基酚极性差异较大，在同一色谱条件下测定分析时间较长，每一个样本的分析时间至少在15分钟以上[4]，不适用于大批量的生物样品分析。同时，氯唑沙宗的吸收波长实验中若适当调大甲醇的比例就可以缩短分析时间，但对乙酰氨基酚的出峰时间也将会提前，而不能与血浆中的内源性物质和杂质分开。另一方面，氯唑沙宗的最大吸收波长是282 nm， 对乙酰氨基酚的最大吸收波长是245 nm，也不宜于同时测定。基于以上问题，我们在预实验中曾采用了梯度洗脱的方法，虽分离较好，但基线漂移较厉害，出峰面积的大小需手动积分，误差较大，且耗时均在10分钟以上，不利于同时测定。综上所述，我们选用了分开测定的方法，建立的方法具有操作简便、快速的特点，分开测定的两组分均能在5.0分钟内完成测定，大大提高了实验效率。

3.2 预实验中据文献[3]报道：对乙酰氨基酚在流动相为甲醇和水的环境下，药物能与血浆中的内源性物质分离较好，且甲醇的用量越少，对乙酰氨基酚得出峰越慢，因此，我们选择了流动相为甲醇∶水=20∶80。在这种条件下，对乙酰氨基酚在3.8分钟左右出峰，且峰形较理想，能与血浆中的内源性物质和杂质分离。氯唑沙宗在流动相为甲醇和水的环境下能与血浆中的内源性物质分离较好，且甲醇的用量越多，氯唑沙宗出峰时间提前，考虑到要与血浆的内源性物质和杂质分离。在流动相为甲醇∶水=60∶40时，氯唑沙宗4.3分钟左右出峰，且峰形较理想，能与血浆的内源性物质和杂质分离，可以确定该流动相适合测定复方氯唑沙宗片中氯唑沙宗的血药浓度。

3.3 对于内标与外标的选择，有文献报道[1，4]测定复方氯唑沙宗片的血药浓度时选用非那西丁作为内标的，在确定的测定条件下，我们也试用了几种内标物质，非那西丁流动相为在甲醇∶水=20∶80条件下，20分钟都未出峰；二羟丙茶碱在6.53分钟出峰，然而在甲醇∶水=60∶40条件下（氯唑沙宗的条件），1.868分钟出峰，很显然不能与血浆的内源性物质和杂质分离。因此，在保证实验条件的前提下，我们选用了外标法测定血浆中药物的浓度。

3.4 本法应用高效液相色谱法同时测定血浆中复方氯唑沙宗片两组分浓度，方法重现性好，回收率高，日内日间变异小，为临床血药浓度监测及药物动力学的研究提供了简单可行的方法。

参考文献：

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[4] 宋立中，石庆平，李见春，等.复方氯唑沙宗胶囊人体药物动力学研究[J].安徽医药，2006，10（9）：650.

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收稿日期：2007-07-06