Livin mRNA在泌尿系恶性肿瘤外周血中的表达及意义

【摘要】目的：研究泌尿系恶性肿瘤患者外周血livin mrna的表达，并探讨其临床意义。方法：采用RT-PCR法，检测16例肾癌患者、21例膀胱癌患者、9例前列腺癌患者和10例非恶性病志愿者外周血Livin mRNA的表达，泌尿系恶性肿瘤患者中14例获得至少半年随访。结果：外周血重复采样阳性率高于单次采样(P

【关键词】膀胱癌；Livin；逆转录聚合酶链反应

文章编号：1009-5519（2007）19-2849-02 中图分类号：R73 文献标识码：A

Expression of Livin mRNA in peripheral blood of bladder cancer patients

GAO Jiang-yuan1，YANG Lin2，ZHENG Xiang-qi2

(1.Teaching and Research Section of Biology，The Medicinal Higher Special School of Chongqing,Chongqing 400051，China；2.Department of Urology，The FourthHospital of Chongqing，Chongqing 400014，China)

【Abstract】Objective：To study the expression of LivinmRNA in peripheral blood of bladder cancer patients. Methods：Using RT-PCR，expression of LivinmRNA was detected in peripheral blood in 16 cancer patients，21 bladder cancer patients 9 prostate cancer patients and 10 non-cancer volunteers，14 cancer patients were followed-up for half one year. Results：The overall positive rates of LivinmRNA in peripheral blood were higher in repetitious tests than in single one test，the overall positive rates of LivinmRNA in peripheral blood of kidney，bladder and prostate cancer patients in repetitious tests were 75% (12/16)，71.4% (15/21) and 77.8%(7/9) respectively；while the positive rates of LivinmRNA in peripheral blood of kidney，bladder and prostate cancer patients in single one test were 43.8%(7/16)，42.9%(9/21) and 44.4%(4/9) respectively.The relapse rate within half one year was higher in LivinmRNA positive patients than in the negative one；none showed positive Livin mRNA in non-cancer volunteers. Conclusion：LivinmRNA is sensitive and specific to detect cancer cells in peripheral blood of patients in m alignant tumor urinary system， Livin mRNA can providea new appropriate target of micrometastasis，assessing the prognosis and scheme of therapy.

【Key words】Bladder cancer；Livin；Reverse transcriptase-polymerase chain reaction

泌尿系恶性肿瘤多为上皮来源性，是临床常见的恶性肿瘤，致死的主要原因是复发和转移，肿瘤细胞在淋巴结、外周血、邻近器官中的微转移是肿瘤转移和复发的基础，及时发现微转移对泌尿系恶性肿瘤复发和预后的判断有重要意义。本研究通过RT-PCR法检测泌尿系恶性肿瘤患者外周血Livin mRNA表达情况，探讨其在泌尿系恶性肿瘤早期诊断、复发监测及预后评估中的应用价值。

1 资料与方法

1．1 资料：46例泌尿系恶性肿瘤患者，均经病理学检查或膀胱镜活检证实，肾癌、膀胱癌及前列腺癌患者分别为16例、21例、9例，男32例，女14例，年龄44~86岁，平均63.8岁，均无远处转移。

1.2 主要试剂与仪器：小量柱离心式组织总RNA抽提试剂盒（上海华舜，批号2402A），逆转录PCR试剂盒（TaKaRa，批号DRR019A）， PCR扩增仪（BIO-RAD Gene CyclerTM）、数字化凝胶成像分析仪（BIO-RAD）。

1．3 方法

1.3.1 抽取空腹外周血3 ml，使用EDTA作为抗凝剂，立即离心，1500 r/minl5分钟，取血清0.6 ml，分装于两个干净的试管，置-80℃冰箱保存备用。

1.3.2 总RNA抽提：按照小量柱离心式细胞总RNA抽提试剂盒操作步骤进行，提取尿液脱落细胞中总RNA。将所提取的总RNA经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定完整性和均一性。

1.3.3 逆转录及PCR扩增：按照TaKaRa逆转录PCR试剂盒进行操作，引物序列[1]Livin sense：5’-GTCCCTGCCTCTGGGTAC-3’;antisense: 5’-CAGGGAGCCCACTCTGCA-3’，逆转录条件为：30℃ 10分钟、48℃ 25分钟、99℃ 5分钟、5℃ 5分钟，PCR反应条件为：95℃ 2分钟、64℃ 45秒、72℃ 30秒，共38个循环，最后72℃再延伸2分钟。同时做内参照β-actin。

1.3.4 琼脂糖凝胶电泳：取PCR产物在2％琼脂糖凝胶（含EB 0.5 μg/ml），170V稳压条件下电泳30分钟，在BIO-RAD数字化凝胶成像分析仪上观察并拍照。

1.4 结果判断：出现368bp和168bp电泳带为Livin mRNA阳性， 仅出现168bp条带为Livin mRNA阴性。

1.5 统计学处理：应用SPSS12.0统计软件进行分析，统计学分析方法为四格表确切概率法。P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 所有标本提取的RNA，经2%琼脂糖凝胶电泳都显示清晰的28S、18S和5S三条区带。RNA电泳结果见图1。

2.2 外周血重复采样阳性率高于单次采样(P

(7/9)；单次外周血采样：肾癌患者Livin mRNA阳性表达率为43.8%

（7/16)，膀胱癌42.9%(9/21)，前列腺癌44.4%(4/9)。10例健康志愿者无Livin mRNA阳性表达。

2.3 外周血中Livin mRNA阳性表达(重复采样)患者的半年局部或远处复发率高于阴性者(P

3 讨论

泌尿系恶性肿瘤在侵袭和转移的早期阶段，就可有微小肿瘤细胞灶播散并存活于血循环，而进人血液的癌细胞仍可表达多种上皮性特异性蛋白，此谓之微转移，此时患者常无任何临床表现，常规检查方法如B超、CT、MRI甚至病理学检查都很难发现，微转移是肿瘤转移、复发的基础和前提，微转移的检测有利于判断预后，指导治疗。

Livin是Ashhab等[2，3]在2000年根据IAP同源序列，用含有BIR序列的EST克隆，在人类基因组cDNA文库中发现的一种新的细胞凋亡抑制因子，研究表明，Livin mRNA在多数肿瘤中高表达，如黑色素瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、白血病以及淋巴瘤等[4，5]， 在正常组织、体液中无表达，且在侵袭、转移、扩散到其他组织器官时，始终保持稳定。通过检测外周血Livin mRNA的表达，可监测泌尿系恶性肿瘤的血行微转移。本研究中，10例非恶性病志愿者Livin mRNA无阳性表达，表明Livin mRNA表达具高特异性。

RT-PCR技术是分子生物学领域中极其敏感的检测方法，有人认为可以检测到每1.0×106个尿液脱落细胞中的1个癌细胞。在极其微量的mRNA模板条件下，经RT-PCR扩增以后仍能检测到目的片段，可见RT-PCR技术的灵敏性很强[6]。我们应用RT-PCR方法检测Livin mRNA在外周血的表达，结果表明，外周血重复采样其Livin mRNA表达具较高敏感性，且阳性率高于单次采样(P

研究结果表明，泌尿系恶性肿瘤患者外周血Livin mRNA的表达与肿瘤的发展演进密切相关，Livin mRNA阳性表达的肿瘤侵袭力强，易转移和复发，所以，随访外周血Livin mRNA阳性表达者对监测泌尿系恶性肿瘤的转移和复发有积极意义。

参考文献：

[1] Ashhab Y，Alian A，Polliack A，et al. Two splicing variants of a new inhibitor of apoptosis gene withdifferentbiological properties and tissue distribution pattern[J]. FEBS Lett，2001，495：56.

[2] Vucic D，Stennicke HR，Pisabarro MT，et al.ML-IAP，a novel in-hibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melano-mas[J].Curr Biol，2000，10(21):1359.

[3] Lin JH，Deng G，Huang Q，et al. KIAP，a novelmember of the inhibitor apoptosis protein family[J].Biochem Biophys Res Commun，2000，279(3):820.

[4] Yagihashi A，Asanuma K，Tsuji N，et al.Detection of antilivin anti-body in gastrointestina1 cancer patients[J]．Clin Chem，2003，49(7)：1206.

[5] Crnkovic-Mertens I，Hoppe-Seyler F，Butz K．Induction of apoptosis in tumor cells by siRNA-mediated silencing of the livin/ML-IAP/KI-APgene[J]．Oncogene，2003，22 (51)：8330.

[6] Buchumensky V，Klein A，Zemer R，et al. Cytokeration20：a new marker for early detection of bladder cell carcinoma[J].J Urol，1998，160:1971.

收稿日期：2007-06-27