自然衰老ICR小鼠进入围绝经期时限的研究

摘 要：目的：探讨自然衰老小鼠进入围绝经的时限。方法：通过观察阴道脱落细胞，了解自然衰老及青年小鼠的动情周期情况，比较其卵巢组织形态及血清中雌二醇（E2）、孕酮（P）、促黄体激素（LH）及卵泡刺激素（FSH）含量，判定小鼠进入围绝经期。结果：11～12月龄的ICR小鼠动情周期紊乱；成熟卵泡减少，黄体数目下调；血清E2、P水平均明显降低，FSH及LH水平均明显升高。结论：11～12月龄的ICR小鼠已经进入了自然围绝经状态。

关键词：自然衰老小鼠；围绝经期；时限

中图分类号：R285.5文献标识码：A

文章编号：1673-7717(2008)05-0974-02

Study on Latitude of Peri-menopausal Period of Natural Ageing ICR Mice

FU Ping,ZHAO Hongli,JIANG Ping,MA Xian

(Hangzhou Hospital of TCM,Hangzhou 310007,Zhejiang,China)

Abstract:Objective:To discuss the latitude of peri-menopausal period of natural ageing ICR mice. Methods:To assess the perimenopausal model of mice,estrous cycles of natural ageing ICR mice and young mice were comprehended through observing cast-off cells of the vagina, and also their tissue appearances of ovaries and contents of estradiol(E2),progesteron（P）,follicule-stimulating hormone（FSH）and luteinizing hormone（LH）in blood serum were compared.Results:Estrous cycles of mice in eleven to twelve months were disordered, and numbers of mature follicle and corepus luteum of their ovary were decreased,while immature follicles were increased. Contents of E2,P in serum were cut down obviously,while FSH and LH rised significantly. Conclusion:Mice of eleven to twelve months were in perimenopausal state.

Keywords:natural ageing mice;perimenopausal period;latitude

围绝经期为妇女40岁以后的任何时期开始，从出现卵巢功能衰退的内分泌、生物、临床表现至停经后12个月内。妇女围绝经期正是担负着社会、家庭重任的时期，月经紊乱及雌激素下降引起的一系列症状对她们的心理、生理、工作都产生了严重的负面影响。

目前在国内外文献中，对于小鼠何时进入围绝经期尚有争议，有报道[1]认为大鼠13～16月龄为围绝经期，另有报道[2-3]认为C57BL/6J小鼠10～14月龄为围绝经期。笔者通过观察比较自然衰老ICR小鼠和青年小鼠的阴道脱落细胞周期变化，卵巢组织形态及血清性激素含量，探讨自然衰老ICR小鼠进入围绝经期的时限，为治疗围绝经期妇女诸病提供实验依据。

1 材 料

1．1 实验动物观察组：ICR小鼠，20只，10月龄，雌性，体重（40±5）g；对照组：青年ICR小鼠，10只，3～5月龄，雌性，体重（18±2）g，浙江中医药大学动物实验中心提供。

1．2 药物及试剂0.9%生理盐水，批号：050803，浙江一新医药股份有限公司；瑞士色素（Wright’s）,上海三爱思试剂有限公司；吉姆萨色素（Giemsa）,上海三爱思试剂有限公司；小鼠性激素（E2、P、FSH、LHELISA试剂盒），大连泛邦化工技术开发有限公司。

2 方 法

2．1 阴道细胞学检查用自制小棉签蘸取少量生理盐水，轻插小鼠阴道内，旋转几圈取出，将含有阴道内容物的棉签顺时针涂在载玻片上，晾干[4]。用瑞氏（Wright’s）试剂（8～10min）及姬姆萨（Giemsa）试剂（1min）试剂双重染色。随后予10×10倍光镜下观察，根据脱落细胞的形态、数量及成熟程度判断小鼠的动情周期及动情频率情况。每日上午涂片1次直至小鼠性周期紊乱，结果以次/周表示。

2．2 卵巢组织形态观察和血清性激素测定 将两组小鼠称重后摘眼球取血，脱颈椎处死小鼠，取出双卵巢

①卵巢组织形态学观察。将卵巢以10%的中性甲醛固定,常规脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察并比较各组子宫及卵巢的组织形态。光镜下观察自然衰老组及青年组小鼠卵巢形态，并计算成熟卵泡、未成熟卵泡、卵泡总数与黄体数目，卵泡总数以每只小鼠卵泡各级卵泡数（成熟卵泡与未成熟卵泡）相加。

②血清性激素测定。两组小鼠眼眶后静脉丛取血后，血液经离心（3000r/s）后取出血清，置于－20℃低温冰箱保存送检，采用双抗体夹心ELISA法检测各组血清E2、P、FSH及LH水平，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。酶标仪双波长（主波450nm，辅助波长630nm）测量各组标本OD值，绘制标准曲线，分别计算各组标本E2（pg/mL）、P（ng/mL）、FSH（ng/mL）及LH（ng/mL）含量。

2．3 统计方法应用统计软件SPSS11.0统计，数值用均数±标准差（±s）表示，两组之间比较用t检验，多组间比较用one-way ANOVA方差分析，多组之间两两比较用LSD及S-N-K分析，均以P＜0.05为有统计学差异，P＜0.01为有显著性差异。

3 结 果

3．1 自然衰老组及青年组小鼠动情周期比较青年组小鼠动情周期规则，呈现动情前期（大量膨大椭圆形扁平上皮细胞）、动情期（角化上皮细胞并聚）、动情间期（大量白细胞，偶见角化及上皮细胞），4～5天为一性周期且规律出现。自然衰老组小鼠经45天观察中发现，自涂片的第30天（即11月龄）开始，动情间期逐渐延长，7～8天甚至10多天为一个性周期，动情频率明显减少，大量白细胞的阴道涂片占多数。13月龄左右动情周期消失，阴道涂片全部为白细胞。见表1。

3．2 自然衰老组及青年组小鼠卵巢形态学比较从镜下观察可见，11个半月龄的小鼠初级卵泡、次级卵泡含量降低，成熟卵泡很少，可见一些凋亡卵泡、较多间质腺及陈旧黄体。而青年组可见原始卵泡及大量初级卵泡、次级卵泡和接近成熟卵泡，黄体较多，间质少，间质腺少见。自然衰老组与青年组相比，成熟卵泡、黄体数目明显减少（P＜0.01），未成熟卵泡数目明显增多（P＜0.01），但是各级卵泡总数减少无统计学差异（P＞0.05）。见表2、图1、图2。

3．3 自然衰老组及青年组小鼠血清性激素比较自然衰老组与青年组小鼠比较，血清E2水平明显降低（P＜0.01），P水平明显降低（P＜0.05）；FSH及LH水平均明显升高（P＜0.01）。见表3。

4 讨 论

目前，很多实验采用卵巢去势法造老鼠的围绝经期模型，或用D-半乳糖法造小鼠的衰老模型。然而，笔者认为卵巢功能衰退是一个渐近的过程，采用去势法或D－半乳糖法造模，不够符合自然衰老规律。去势以后，阴道涂片显示全部为白细胞，显示动情周期完全消失，提示老鼠完全进入绝经期而非围绝经期。而用D－半乳糖法[5]造成糖代谢紊乱，在较短时间内使正常青年小鼠衰老，从一些指标上看与自然衰老无显著差异，但这毕竟是一种非正常衰老，对机体另外一些生化指标则有明显影响。所以根据文献，笔者选择自然衰老10月龄的ICR小鼠，摸索探讨其进入围绝经期的时限。自然衰老的ICR小鼠，其年龄、体重、健康状况均符合自然状态，并且相对大鼠较为经济。

阴道上皮的成熟程度与体内的雌激素水平成正比。当雌激素水平低下时，角化上层细胞、表层细胞减少，阴道涂片偶见角化及小圆形、卵圆形的上皮细胞，可见大量的白细胞。因此阴道涂片是生物测定雌激素效能的常用方法，反映卵巢的变化，是动情周期各阶段的简便检测指标。本实验中，10月龄起观察的自然衰老组小鼠自第30天（即11月龄）开始，相比青年组小鼠，其上皮细胞的角化程度显著降低，动情周期明显延长甚至紊乱，动情频率明显减少，符合围绝经期的生理变化。

围绝经期[6]最早的变化是卵巢功能衰退，从此期开始，卵巢渐趋停止排卵，卵泡不能发育成熟，卵泡闭锁，雌激素分泌减少。本实验中11个半月龄的ICR小鼠，卵巢组织形态观察其成熟卵泡数目、黄体数目与青年组小鼠相比均有不同程度的衰退或下调趋势，未成熟卵泡增多，显示此时限自然老化的小鼠卵巢储备功能已开始下降，甚至开始衰竭，已进入围绝经状态。

卵巢对维持女性的内分泌功能和植物神经功能平衡有重要意义，卵巢激素水平的下降，主要是E2水平下降，对于下丘脑－垂体的反馈减弱，致使FSH、LH分泌增多。实验中经ELISA方法检测得出，11个半月龄的ICR自然衰老组小鼠相对青年组E2、P水平显著下降，由于负反馈减弱使得促性腺激素FSH、LH明显升高。

综上所述，笔者的研究显示，11～12月龄小鼠相当于人类围绝经期的起始时期，13月龄则相当于人类绝经期。有关围绝经期疾病的动物实验研究，在ICR小鼠的11～12月龄进行为宜。

参考文献

［1］ 秦佳佳，陈慧铮，田旭升，等．坤宁安对围绝经大鼠卵巢功能的影响[J]．中医药信息，2004，21(6)：47－49.

[2] 朱晓晖，王军，印彤．雌激素干预影响腹腔脂肪积聚的实验研究[J]．中国临床药理学与治疗学，2003，8(6)：669－672.

[3] Belisle S,Bellabarba D,Lehoux JG.On the presence of nonfunctional uterine estrogen receptors in middle-aged and old C57BL/6J mice［J］.Nov-Dec,2001,74(4/5):653-658.

[4] 孙敬方．动物实验方法学[M]．北京：人民卫生出版社，2002(3)：250.

[5] 唐粉芳，金宗濂，王磊，等．半乳糖亚急性致衰老模型的研究[J]．北京联合大学学报，1994，8(1)：30－32.

[6] 洪家铁．中西医临床妇科学[M]．北京：中国中医药出版社，1999，3：411－415.