细胞纤维化在牙周炎中的作用

本文作者：潘倩茹 吕芳丽 黄博 陈莹 刘曼 黄世光 单位：暨南大学医学院口腔医学系 广州中山大学医学院寄生虫教研室

传统认为肥大细胞主要参与IgE介导的过敏反应，但近年人们开始认识到肥大细胞作为关键细胞，在固有免疫的建立和获得性免疫反应的调节中扮演着重要的角色［1］。肥大细胞是宿主抗感染免疫防御细胞，然而肥大细胞与牙周疾病的关系在国内尚未见报道。本实验通过观察不同病变程度牙周炎中肥大细胞的数量、脱颗粒率和牙周组织的纤维化程度，分析肥大细胞在牙周感染中的免疫反应作用及其与牙周炎症程度的相关性。

1材料和方法

1．1研究对象

1．1．1牙周炎病例选择2008～2010年在暨南大学第一附属医院牙周科门诊就诊的20～60岁成年人，无糖尿病和其他系统疾病;纳入标准依据美国牙周病学会1999年的牙周病新分类指南［2］;所有受试者均签署知情同意书。

1．1．2分组轻度慢性牙周炎组:牙龈有炎症，探诊出血，牙周袋≤4mm，附着丧失≤2mm，共17例，为接受牙周翻瓣术者;重度慢性牙周炎组:牙周袋＞6mm，附着丧失≥5mm，牙松动Ⅲ度，共18例，为无保留价值或预后极差的患牙需要拔除者;正常对照组:15例，取自因正畸治疗需要拔除的正常前磨牙且牙周健康者。

1．2实验方法

1．2．1组织标本采集、处理与观察牙龈标本于4%中性甲醛液中固定48h以上，制成5μm厚度切片，HE染色，光学显微镜下观察牙周组织学改变。由2名病理医师盲法观察，对牙周组织的炎细胞浸润情况进行评分，求其平均值。炎症程度评分标准如下:0:无炎症细胞浸润;1:轻度炎症，炎症细胞局部呈小灶状浸润;2:中度炎症，炎症细胞呈灶状及片状浸润;3:重度炎症，炎症细胞在牙周组织内呈弥漫性浸润。

1．2．2纤维化染色和等级评分标准采用天狼猩红染色来观察牙周组织胶原纤维的沉积情况。结果由2名病理医师在光镜下盲法观察，对牙周组织胶原纤维的沉积情况进行评分，求其平均值。评分标准如下:0:正常牙周组织，无胶原纤维沉积;1:出现少量胶原纤维;2:胶原纤维沉积增多并迁延;3:大量胶原纤维呈弥漫性分布，出现条索状或薄层状胶原纤维。

1．2．3牙周组织肥大细胞及脱颗粒观察采用甲苯胺蓝染色法来观察肥大细胞及其脱颗粒的情况。染色切片由2名作者于光镜下观察肥大细胞形态并计数，取其平均值。形态判定方法:细胞膜完整、细胞核染色清楚的为稳定状态肥大细胞;细胞核破裂、周围组织中存在蓝染状颗粒的为脱颗粒肥大细胞。计数方法为:每张切片在高倍视野(×400)下选取肥大细胞数目最多的5个视野进行计数，计算5个视野肥大细胞总数和脱颗粒率各自的平均值。脱颗粒率=(脱颗粒肥大细胞数/肥大细胞总数)×100%。

1．2．4统计学分析应用GraphPadPrism统计学分析软件进行分析，不同组间的牙周组织病理学观察数据使用Wilcoxon符号秩检验分析，不同组间的肥大细胞数量和脱颗粒百分率用Student＇st检验分析。

2结果

2．1组织学观察正常对照组:没有发现炎性细胞浸润(图1A);轻度慢性牙周炎组:有少量散在炎性细胞浸润(图1B);重度慢性牙周炎组:表现出明显的炎性细胞浸润，有单核细胞分布和点状破坏，出现大范围的淋巴细胞、浆细胞和肥大细胞浸润，可见散在分布的巨噬细胞样细胞及多形核细胞(图1C)。图2表明重度慢性牙周炎组的得分明显比轻度慢性牙周炎组高(P＜0．05)。

2．2肥大细胞数量和肥大细胞脱颗粒情况正常对照组:牙周组织中肥大细胞数量极少，且不伴脱颗粒现象(图3A);轻度慢性牙周炎组:肥大细胞数量显著增加伴脱颗粒现象(图3B);重度慢性牙周炎组:有大量的肥大细胞和明显的脱颗粒现象(图3C)。图4显示:与正常对照组相比，牙周炎组的肥大细胞和脱颗粒的肥大细胞数量明显上升(P＜0．01)，其中，重度慢性牙周炎组显著高于轻度慢性牙周炎组(P＜0．01)。

2．3纤维化程度分析正常对照组:天狼猩红染色不明显，提示在正常对照组中缺乏胶原纤维沉积(图5A);轻度慢性牙周炎组:可见炎症细胞浸润和胶原纤维沉积(图5B)。重度慢性牙周炎组表现为显著的炎症细胞浸润和呈细线状或板块状的胶原纤维沉积(图5C);图6显示随着牙周炎症程度的加重，牙周组织的纤维化程度亦加重。

3讨论

肥大细胞通常分布在如皮肤、消化道等机体与外界环境相通的地方，与树突状细胞一起是造血－免疫系统中首先与环境中的应变原、病原体接触并相互作用的细胞群体。肥大细胞和免疫反应的其他细胞之间存在潜在的功能性联系，激活的肥大细胞紧邻浆细胞和淋巴细胞，在各种获得性免疫反应包括多种炎症反应性疾病中相互作用［3］，活化的效应T细胞激活肥大细胞，导致其脱颗粒和释放多种细胞因子包括组织胺(histamine，HA)、白三烯、血小板活化因子、碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)、肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)和一氧化氮等［4］。关于肥大细胞在牙周炎组织中的作用，有观点完全相反的报道。Gemmell等［5］观察到肥大细胞在慢性牙周炎组织中的数量比正常牙龈组织少，但Batista等［6］的研究显示肥大细胞的数量在慢性牙周炎组织较正常牙龈组织增加。本研究观察到肥大细胞在慢性牙周炎中的数量较正常牙龈组织明显增多且有明显的脱颗粒现象，提示肥大细胞可能参与慢性炎症的防御和破坏机制，结果与Batista等的研究一致。肥大细胞作为效应细胞及其释放的活性介质在牙周病中的作用尚未明确。Zhang等［7］的研究发现，TNF-α能够诱导内皮细胞E选择素的表达，使中性粒细胞、T淋巴细胞、单核细胞、白细胞等黏附和聚集;同时，肥大细胞募集除了在宿主牙周感染免疫反应中起着关键作用外，也可能在牙槽骨吸收的病理过程中发挥潜在作用。肥大细胞介质如肝素、HA、神经蛋白酶、前列腺素、白细胞介素等可影响骨的转换和重建［8］。Dobigny等［9］在动物模型中观察到，阻止小鼠的HA摄入量可以抑制破骨细胞的激活，使破骨细胞的生成数量减少，说明肥大细胞释放的HA等介质参加骨代谢调节的过程。TNF-α参与破骨细胞的分化和增殖［10］以及诱导金属蛋白酶的表达，而金属蛋白酶能够促进胶原和其他细胞外基质蛋白裂解，从而引起组织的破坏。在我们的研究中，健康牙龈组织几乎观察不到纤维化的现象，在慢性牙周炎组织中出现明显的纤维化现象，纤维化的严重程度在重度慢性牙周炎组显著高于轻度慢性牙周炎组。同时，脱颗粒的肥大细胞数在重度慢性牙周炎组明显地高于轻度慢性牙周炎组，提示在慢性牙周炎中肥大细胞可通过释放活性介质以刺激成纤维细胞增殖和胶原沉积，从而导致牙周组织纤维化。许多研究发现，肥大细胞是促成各种纤维化的条件，其合成和分泌活性介质和细胞因子，如类胰蛋白酶、糜蛋白酶、HA、肝素和细胞因子如TNF-α、bFGF等刺激成纤维细胞增多和细胞外基质积聚，促进组织纤维化［11］。Gruber等［12］发现类胰蛋白酶能够促进成纤维细胞增生，激活胶原酶，刺激原胶原向纤维胶原转化，在体外诱导成纤维增殖和胶原蛋白合成。肥大细胞对成纤维细胞的功能调节主要是通过释放的活性物质介导，两者相互作用，既参与复杂的炎症反应又参与组织纤维化的发生发展。通过调节肥大细胞的功能活动将为防治牙周病提供有价值的依据、制订更好的治疗措施。