骨桥蛋白在骨界面改建的意义

本文作者：袁林 童心 李方舟 曹凯华 单位：广州医学院第一附属医院口腔科 中山市人民医院口腔科

随着经济的发展以及社会老龄化的加快，越来越多的患者需要并且选择种植义齿来修复口腔牙列缺损或牙列缺失［1］。临床上传统的埋植型种植义齿应用已经非常广泛，但是非埋植型只通过一次手术完成、植入后适当的功能刺激更有利于种植体周围骨的生长改建，近年来临床应用逐渐增多［2］。骨桥蛋白(os-teopontin，OPN)是一种骨组织中主要的细胞外非胶原基质蛋白，与骨组织的矿化和吸收有关。有学者研究发现即刻植入种植体后受载产生的应力能增加骨桥蛋白的表达［3］，但其调节机制尚不完全清楚。本实验拟通过比较埋植型和非埋植型这2种不同的种植方式，研究义齿修复受载后种植体－骨界面中骨桥蛋白的动态变化规律，初探OPN在界面改建过程中的分子机制。

1材料与方法

1．1动物模型的建立和组织标本的制备选用健康雄性Beagle纯种犬(中国人民军事科学研究院提供)8只。按文献［4］的方法实验犬以30g/L戊巴比妥钠按1ml/kg肌肉注射行全身麻醉后，在拔牙前取全口印模以记录正常的咬合关系，然后拔除双侧下颌第4前磨牙和第1磨牙。拔牙创愈合3个月后，行纯钛种植体植入。每只实验犬下颌左侧均植入埋植型种植体3枚，右侧均植入非埋植型种植体3枚，8只实验犬共植入种植体48枚(埋植型与非埋植型各24枚)。种植体植入后3个月，行埋植型种植体的二期手术。同时，用口镜柄叩击所有种植体基桩以检查其稳定性。用临床常用方法检测种植体松动度及牙周情况。埋植型种植体二期手术后7d拆线，同时参照拔牙前所记录的研究模型制作个别托盘取终印模。灌注的工作模型依据拔牙前所记录的颌位关系上架，在其上制作种植义齿。双侧第1个种植体均不修复，作为对照。在第2、3个种植体上模拟犬天然第一磨牙外形制作蜡型。钴－铬合金铸造金属全冠修复。在模型上反复调。口内戴牙，调。统一的颗粒状硬质饲料(军科院提供)定时、定量喂养，自由饮水。每周2次2g/L洗必泰清洁口腔。实验犬分别在加载后2、4、8、12周时各处死2只。采用4%甲醛液心内灌注的方式行内固定。取出下颌相应骨段，在种植体外周10mm处将颌骨截开离断。标本均置于100g/LEDTA中脱钙3个月。梯度乙醇脱水，石蜡包埋。标本采用颊舌向纵切，厚约4μm，裱于经APES涂布的玻片上。

1．2实验方法免疫组化ABC法及主要试剂:OPN多克隆抗体(美国SantaCruz公司)，ABC试剂盒(美国Vector公司)。按试剂盒说明免疫组化染色，DAB显色。以封闭血清代替一抗作为阴性对照。双侧第1个不修复的种植体作为阳性对照组。

1．3图像分析与统计学处理采用HPIAS-1000彩色图文分析仪(Olympus，BX40)，对实验组和对照组各时间点种植体－骨界面的OPN免疫组化染色强度进行测量。每张切片测量其种植体－骨界面所有区域骨组织的平均灰度值。每个标本取4张切片求其平均值。结果采用配对t检验进行统计学分析。

2结果

2．1对照组(未修复组)种植体骨界面组织中存在OPN弱阳性表达，其免疫阳性信号位于胞质内。各时间点表达无明显变化，无一定规律(图1～2)。

2．2非埋植型实验组种植体骨界面组织表达OPN阳性强度明显高于对照组，且表达出现一定规律:即受载后2周开始出现较明显的变化，随后阳性强度逐渐增大，并于8周时达高峰(图3)，随后于12周时基本恢复至与对照组水平一致(图4，表1)。

2．3埋植型实验组种植体骨界面组织表达OPN阳性强度明显高于对照组，且表达出现一定规律:即受载后2周开始出现较明显的变化，随后阳性强度逐渐增大，并于8周时达高峰(图5)，随后于12周时基本恢复至与对照组水平一致2．4受载后各时间点埋植型和非埋植型实验组之间OPN的表达无明显差异。

3讨论

OPN是一种骨组织中主要的细胞外非胶原基质蛋白，在成熟中的成骨细胞和破骨细胞中高水平表达，是成骨细胞在基质形成和成熟阶段的特征性标志物，骨组织中骨桥蛋白能调控骨细胞和骨的更新，调节成骨细胞的表型。此外，骨桥蛋白还参与促进细胞黏附和细胞聚集、加强或抑制细胞因子表达、启动信号转导、促进矿化作用等［5］。种植体－骨界面之间的理想形式是形成良好的骨整合，这是骨内牙种植体获得临床长期成功的基础。临床上骨内牙种植体常用的方式为埋植型，经典的Branemark种植体系统即主张有三个月以上的完全无载荷愈合期。但由于非埋植型种植体存在它的一些特殊优势，近年来临床应用逐渐增多。之前的学者们多是从宏观和形态学方面对埋植型和非埋植型种植体进行研究。本实验直接比较了埋植型和非埋植型这两种不同的种植方式，采用免疫组化法，观察义齿修复受载后种植体－骨界面中骨桥蛋白的动态变化情况，从分子生物学的蛋白水平去探讨这两种不同种植方式种植义齿骨界面改建的异同。结果显示，未修复对照组种植体－骨界面组织中存在OPN弱阳性表达，各时间点表达无明显变化;埋植型和非埋植型实验组种植体－骨界面组织表达OPN阳性强度明显高于对照组，且表达出现一定规律:受载后2周开始出现较明显的变化，随后阳性强度逐渐增大，并于8周时达高峰，随后于12周时基本恢复至与对照组水平一致;且受载后各时间点埋植型和非埋植型实验组之间OPN的表达无明显差异。研究结果提示机械负荷能在不同的时间促进OPN的不同表达。班宇［3］通过建立即刻种植的渐进性垂直加载Beagle犬颌骨实验模型，观察到在加载组界面成骨细胞和骨基质中，骨桥蛋白的表达均明显强于无载荷组。袁林等［6］通过对埋植型与非埋植型牙种植体骨界面改建的HE染色组织学研究观察到的变化规律与该实验结果一致。Fujihara等［7］通过包埋后免疫金技术观察骨钙蛋白(Osteocalcin，OC)和OPN在骨－钛界面位置和分布，发现这两种蛋白质均广泛分布于新形成的骨组织中，主要聚集在骨组织临近钛的区域、骨中电子致密斑和骨细胞陷窝中。OPN在朝向钛的第二个电子致密层即限制板中强表达，而在无定形区域内OC强表达，而OPN仅弱表达。骨组织通过富含OC的无定形区域与钛接触，OC与OPN一起调节最接近钛区域的矿化，并且作为细胞－基质和基质－基质/矿化物沿着钛黏附的媒介。OPN主要通过αvβ3整合素介导初始破骨细胞识别并黏附于骨组织，然后OPN再通过αvβ3调节破骨细胞功能。Katsunori等发现骨桥蛋白广泛的分布于种植体周围新形成的骨组织中，特别聚集于粘合线和骨界面。Beyeler［8］研究发现骨桥蛋白有RGD三肽序列，介导着成骨细胞和破骨细胞对骨基质的黏附，并且通过与αvβ3整合素反应刺激破骨细胞迁移，促进骨吸收。本实验通过免疫组化方法观察种植义齿修复后其界面OPN的动态变化，比较埋植型和非埋植型这两种不同植入方式种植义齿修复在改建过程中的异同。结果表明，种植义齿受载后其种植体－骨界面表达OPN随受载时程而改变，影响着界面的改建。埋植型和非埋植型种植义齿之间无显著差异。