桂附地黄丸对大鼠脑组织的影响

本文作者：宋建平 谢忠礼 杨美凤 李 伟 李瑞琴 张 瑞 单位：河南中医学院 河南省濮阳市中医院

肺纤维化是多种弥漫性肺间质疾病的不良转归，目前尚无治疗良策。近年来，中药治疗肺纤维化报道较多，但在以往运用肺纤维化疾病模型进行中药防治实验研究时，多未能注意针对不同病变阶段;且从神经、内分泌与免疫系统整体调节方面研究中药作用机制较少。我们以往的实验结果提示，桂附地黄丸能减轻平阳霉素复制大鼠肺纤维化模型不同阶段(造模后1d～7d，造模后14d～28d)肺泡炎及纤维化的程度，影响1d～7d时肺与脑中去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)含量，抑制14d～28d时模型肺组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)与白细胞介素10(IL-10)的过度表达［1～4］。本实验通过观察桂附地黄丸对肺纤维化模型形成阶段(14d～28d)肺及脑中NE、DA、5-HT的影响，探讨其对肺纤维化形成阶段神经、内分泌等系统的干预作用。

1材料与方法

1．1实验材料

1．1.1动物普通级健康Wistar大鼠，雌性，体重200g±20g，由河南省动物实验中心提供(动物许可证号410116)。饲养于河南中医学院动物实验中心，室温22℃±2℃，相对湿度60%，常规饲料喂养，饮水量不限。

1．1.2主要实验药品平阳霉素:哈尔滨博莱制药有限公司产品(批号07010203，规格:8mg/支);桂附地黄丸:宛西制药厂产品(批号070602);泼尼松片:浙江仙琚制药股份有限公司(批号为070608);多巴胺标准品:阿法埃莎(天津)化学试剂有限公司(批号10097602);5-羟色胺标准品:阿法埃莎(天津)化学试剂有限公司(批号10119987);去甲肾上腺素标准品:阿法埃莎(天津)化学试剂有限公司(批号10131292);正丁醇:天津化学试剂一厂(批号20070406);浓盐酸:洛阳昊华化学试剂厂(批号20060208);正庚烷:天津化学试剂一厂(批号20050828);邻苯二甲醛:天津化学试剂一厂(批号20060403)。

1．1.3主要实验仪器F-4500荧光分光光度计，日立(HITACHI);752N型紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司产品。

1．2实验方法

1．2.1动物分组实验大鼠正常饲养3d后，按体重采用随机数字表方法将其随机分为正常组、模型组、泼尼松组、桂附地黄丸组，每组12只。

1．2.2造模与用药(1)造模:本实验除正常组正常饲养不做任何处理外，模型组及用药组按文献方法造模［5］，将平阳霉素用生理盐水配制成3mg/ml，以水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，取仰卧固定位，常规消毒，行颈正中切口，钝型分离暴露气管，经气管软骨环间隙向心端穿刺注入平阳霉素生理盐水溶液0.1ml/100g(平阳霉素3mg/kg体重)，立即将动物直立并行旋转，使药液在肺内分布充分、均匀，缝合皮肤，待动物自然清醒后置笼内常规饲养;(2)用药:从造模后第14天开始，桂附地黄丸组按1.8g/kg体重给药，使用时用蒸馏水配制成120mg/ml，按1.5ml/100g灌胃给药;泼尼松组按4mg/kg体重给药，使用时用蒸馏水配制成0.267mg/ml，按1.5ml/100g灌胃给药;模型组灌入等量蒸馏水。每天给药1次，1周后复查动物体重以调整给药量，各组于造模后第28天处死。

1．2.3观察指标与方法实验结束时快速断头取全脑，在经冰冻处理的玻片上分离出下丘脑和海马，置于聚丙烯管中于-80℃保存直至测定;取右肺组织0.5g，研磨成匀浆，采用荧光分光光度法检测肺与下丘脑和海马组织匀浆液中NE、DA、5-HT-HT含量，操作程序见文献［6］。

1．3统计学处理数据采用SPSS13.0统计软件包处理，双侧检验，取α=0.05，对服从正态分布的计量资料数据以均数±标准差(x珋±s)表示，组间差异性判断采用单因素方差分析，方差齐时用LSD法，方差不齐时用DunnettT3检验。

2结果

2．1肺组织NE、DA、5-HT含量比较表1显示，模型组肺组织NE、DA、5-HT含量均高于正常组、桂附地黄丸组与泼尼松组，桂附地黄丸组NE、DA含量高于泼尼松组而5-HT低于泼尼松组，上述差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

2．2下丘脑NE、DA、5-HT含量比较表2显示，模型组下丘脑NE、DA、5-HT含量均高于正常组，桂附地黄丸组NE、DA含量低于模型组与泼尼松组，5-HT含量高于泼尼松组，泼尼松组DA、5-HT含量低于模型组，上述差异均具有统计学意义(P＜0.05)。2．3海马NE、DA、5-HT含量比较表3显示，模型组5-HT明显高于正常组，桂附地黄丸组NE、5-HT含量低于模型组，DA高于模型组、泼尼松组与正常组，泼尼松组NE高于模型组与桂附地黄丸组，DA、5-HT含量低于模型组，上述差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

3讨论

NE、DA和5-HT是参与神经、内分泌与免疫系统调节的重要物质，以往对上述物质与神经、内分泌系统生理、病理及精神疾病关系的研究较多，近年来人们开始关注它们与其他系统生理、病理及与中医“证”的关系。如有人研究发现，神经系统在肝纤维化的发生与发展过程中发挥着重要作用，NE能促进肝纤维化的发生发展［7］。还有人研究发现，肝气郁证与下丘脑中NE、E、DA、5-HT关系密切;肾阴虚大鼠下丘脑NE、DA、5-HT含量降低，肾阳虚大鼠下丘脑NE、DA含量升高，5-HT含量降低，但无显著性差异［8，9］。中西医认为，肺的主要生理功能是司呼吸。《素问•灵兰秘典论》说:“肺者，相傅之官，治节出焉”，指出肺还有治理调节全身的作用;西医也认为肺还是调节NE、DA和5-HT等活性物质使机体内环境稳定的重要器官;两种医学体系均认识到肺除呼吸外的其他功能。肺主治节、调节上述活性物质的作用发生变化，造成这些物质相互间平衡协调关系破坏，对一些疾病的发生发展可能具有重要意义，也可能影响全身。如有人提出肺对血管活性物质的清除(灭活)功能不足或释放过多，可能是急性呼吸窘迫综合征或肺慢性疾患(如肺纤维化)的重要发病因素［10］。5-HT可兴奋支气管平滑肌，支气管哮喘病人对其特别敏感，5-HT持续增高者，哮喘不易控制，且预后不良［11］。成纤维细胞和胶原纤维过度增生与纤维化病变关系密切，而成纤维细胞合成胶原纤维的速度与5-HT有关［12］。中医认为，肺主呼吸，肾主纳气，肺的呼吸需要肾纳气作用维持，即肾有帮助肺保持吸气深度、防止呼吸浅表的作用。肾中精气充足，吸入之气才能经过肺之肃降而下纳于肾;若肾中精气亏损，不能助肺吸气，可致气浮于上而出现呼吸浅表、气喘等，中医称为肾不纳气。肺纤维化临床上以进行性呼吸困难为主要表现，不少医家根据中医理论，结合临床诊治，提出肾虚是其主要病机。桂附地黄丸来源于中医经典《金匮要略》中的肾气丸，是补益肾气名方，临床上有运用补肾治法与方药减轻肺纤维化临床症状的报告。我们以往的实验结果提示，桂附地黄丸能减轻平阳霉素复制大鼠肺纤维化模型化形成阶段肺部病理损害程度。本实验结果表明，肺纤维化形成阶段，模型肺组织NE、DA、5-HT含量均高于正常组，可能是由于肺部病理损害而影响了其对DA、NE、5-HT的灭活;桂附地黄丸能阻止模型肺组织NE、DA、5-HT含量的升高，可能是通过补益肾气而减轻肺部病理损害，从而保护肺对上述物质的调节功能，肺纤维化形成阶段肺组织DA、NE、5-HT含量升高对肺纤维化病变及整体生命活动的影响和中药对其的作用有待进一步研究。机体神经内分泌免疫网络功能的紊乱在许多疾病过程中可能起着重要作用，目前研究肺纤维化病变过程中神经、内分泌和免疫系统变化的报道较少。下丘脑不仅参与体温、液体平衡和内分泌系统的调节，对外周的单胺能神经系统也具有调节作用，是执行神经内分泌免疫调节的高级中枢。海马是边缘系统的重要结构，有研究表明，免疫应答可能使下丘脑和海马中儿茶酚胺能神经活动加强［13］。本研究发现，在肺纤维化形成阶段，模型组下丘脑NEDA、5-HT含量均高于正常组，海马NE、DA与正常组无明显差异，而5-HT含量高于正常组，提示下丘脑去甲肾上腺素和多巴胺、5-羟色胺能神经及海马区5-HT能神经活动在肺纤维化形成阶段可能发生了变化;桂附地黄丸组下丘脑NE、DA含量均低于模型组，海马DA含量高于正常组和模型组，NE、5-HT含量低于模型组，其中NE含量低于正常组，提示具有补益肾气作用的桂附地黄丸可能阻止肺纤维化形成阶段下丘脑NE、DA及海马5-HT含量的升高，并能降低海马NE含量、提高DA含量，从而影响下丘脑、海马区的神经活动。结合同期桂附地黄丸对模型肺部病理损害程度、肺组织中TNF-α与IL-10的表达影响的观察结果，提示桂附地黄丸防治肺纤维化的作用可能与调节神经、内分泌与免疫系统功能有关，这与桂附地黄丸补益肾气、纳气平喘功能的关系值得进一步研究。上述研究结果还提示，肺纤维化形成阶段肺与下丘脑去甲肾上腺素、多巴胺和5-羟色胺能神经活动变化可能一致，而海马去甲肾上腺素、多巴胺能神经活动的变化尚不能肯定;桂附地黄丸对模型肺、下丘脑与海马去甲肾上腺素、多巴胺和5-羟色胺能神经活动的影响并不完全相同。桂附地黄丸与泼尼松虽然均能减轻平阳霉素复制大鼠肺纤维化模型不同阶段(造模后1d～7d、造模后14d～28d)肺泡炎及纤维化的程度，但对模型肺、下丘脑与海马去甲肾上腺素、多巴胺和5-羟色胺能神经活动影响趋势并不完全相同。此外，与造模后第7天实验结果比较，各组肺组织中NE、DA、5-HT含量变化趋势相同，而脑组织中上述物质的变化趋势并不完全相同。在肺纤维化形成过程中神经、内分泌、免疫系统的变化及相互作用和它们与中医所论病机的关系以及中药对上述变化的影响等问题尚需进一步观察研究。