小儿肌性斜颈动物模型研制

摘要　目的：探讨小儿肌性斜颈(congeniIal Muscular Torticollis CMT)动物模型的制作方法。方法：将48只健康幼兔随机分为胸锁乳突肌(SCM)颈外静脉结扎(A)、无水酒精注射(B)、消痔灵注射(C)和空白对照(D)四组；每组于第15天和第30天分两次各处死6只标本，分别对其斜颈情况、胸锁乳突肌外观进行观测，并行肌肉纤维化指标(HE和a－SMA)的测定。结果：A、B、C三种方法均可导致幼兔scM外观增粗，并检出纤维组织增生及a―SMA阳性表达，但是无水酒精注射组的纤维组织增生较其他两种方法更为明显，且出现时间更早。结论：无水酒精注射法制作CMT幼兔模型较为理想，有推广运用价值。

关键词　幼兔　先天性肌性斜颈　动物模型

顾名思义，小儿肌性斜颈存在着头颈偏斜；且偏斜是因为肌肉畸形。实际上，该病正是因为一侧胸锁乳突肌局部纤维化，以及由于纤维化后的挛缩、牵拉导致小儿头颈编斜。目前认为该病的发生可能与遗传、胎儿发育不良、产伤和动作姿式不当等有关。传统中医推拿疗法对该病有很好的疗效，各地报导有效率均在80％以上；加之推拿过程舒适，无毒副作用等而使其成为了CMT的治疗首选。但推拿治疗该病的机理，特别是已经纤维化了的肌肉能否逆转等却一直困绕着学术界。要回答上述问题，首先需要建立起以纤维化为特征的斜颈动物模型。为此，我们探讨了运用颈外静脉结扎、注射无水酒精和消痔灵等方法塑造CMT动物模型的可能性。现报导如下：

1　实验材料

1.1　实验对象　成都中医药大学动物实验中心提供4～5周龄清洁级，检疫合格的幼兔48只，雌雄各半，体重450g～550g。饲养于不锈钢笼内。室温15～20℃，相对湿度70％。

1.2　实验分组　将实验幼兔随机分为A(颈外静脉结扎)、B(无水酒精)、c(消痔灵)和D(空白对照)共4组，每组12只。

2　实验方法

2.1　造模方法　A组：参考谢宝姗报导方法，以10％水合氯醛按幼兔体重1.2ml/Kg实施麻醉，后暴露幼兔右颈部；常规剃毛、消毒，沿SCM外缘纵向切口约6cm，分离出颈外静脉；用3号线将静脉结扎；重新缝合皮肤：待其自然苏醒。术后每只幼兔给予青霉素3万单位肌注，连续3天。B组：按1ml/Kg确定无水酒精量，用2ml注射器准确刺入SCM中段(约0.2～0.5cm深)，确认无回血，将无水酒精缓缓注入。注射完毕后无需任何处理。c组：方法同B组。按1ml/Kg注入消痔灵注射液。D组：不做任何处理。

2.2　标本制作沿幼兔耳背静脉注入空气，致死。沿右侧SCM外缘纵向切口，暴露完整的SCM，肉眼观察后，取中段组织(长约0.5cm)，FAA液固定，制片，供病理检测。

2.3　观察指标

2.3.1　肉眼观察颈部畸形情况

2.3.2　肉眼比较SCM外观

2.3.3　实验室指标：①HE病理检测：该反应了肌肉组织纤维化及程度。参照Szapiel等，在光镜下将SCM纤维化程度分为：0级无纤维化；1级小灶性，见单个纤维组织增生；2级灶性，2个纤维组织增生；3级多灶性，3个及以上纤维组织增生；4级明显，即大量、成片纤维组织增生。②α－平滑肌肌动蛋白(α－SMA)免疫组化检测：该为肌纤维母细胞细胞表型标志性蛋白。采用四川大学图像图形研究所提供的Mias-2000图形分析系统，定量检测切片中α－SMA的表达水平。由计算机自动输出每张切片阳性细胞占全屏的面积(比例)。

2.4　实验步骤　各组幼兔于实验前适应性饲养1周，随机分组。然后给予相应处理(A颈外静脉结扎，B无水酒精，c消痔灵，D空白)。15天后各组处死6只(一半)，制作标本，进行观察比较；30天后同法比较。

3　统计学处理

所有资料采用SPSS13.0统计软件包。两组计量资料采用成组t检验；多组计量资料采用单因素方差分析(One-way ANOVA)；多组等级资料采用非参数秩和检验。

4　结果

4.1　各组造模前基线比较：造模前A、B、C、D四组各12只幼兔平均体重经统计学处理P>0.05，说明均衡性较好，具有可比性。

4.2　颈部活动情况三组模型动物与空白组相似，均未见明显颈部偏斜。

4.3　SCM外观造模15天SCM外观见表1；造模30天后除A组SCM粗细和血管情况与B组相同外，其余观察内容无改变。

4.4　HE病理检测

4.4.1　造模15天HE比较(见图1)

4.4.2　造模30天HE比较(见图2)

4.5　a－SMA免疫组化测定

4.5.1　造模15天后：只有B组出现了阳性表达(见图3)。

4.5.2　造模30天后(见图4、表2)

6　讨论

6.1　CMT动物模型成功的标志　动物模型是指在医学实验中用动物模拟人体的生理、病理，甚至是心理状态的一种模型。由于医学探索具有未知性和风险性，许多实验不允许，也不可能，或没有必要直接在人体进行，就只能根据需要选择适宜的动物、运用恰当的方法，将动物复制成研究所需要的与人类相似的状态，这就是造模过程。据此，要塑造CMT动物模型就应该使该模型满足小儿肌性斜颈的临床和病理特征，即临床上头偏向患侧，下颏转向健侧；以及病理上SCM局部出现条索、硬结等纤维组织。我们所用的颈外静脉结扎、注射无水酒精和消痔灵等三种方法所塑造的模型均未见到幼兔头颈偏斜，即未能塑造出符合临床特征的CMT模型。其原因可能有：(1)人类是直立动物，头颈与身体轴线(脊柱)同一，并垂直于地面，肌性斜颈为其在额状面上的偏斜和沿中轴的旋转，这对于人类来说非常直观，容易观察；而家兔一类爬行动物，纵轴线(脊柱)几乎平行于地面，头部和颈部并不与地面垂直，如果某侧SCM短缩牵拉，多形成头部的前屈而侧偏不明显。(2)家兔颈短，一般处于“缩颈”状态，只有当警觉、觅食等情况才伸长颈项。理论上，即使SCM短缩，缩颈时也不易出现斜颈；只有当伸颈时肌肉短缩与牵拉才容易显现出来。而实验中的幼兔由于SCM损伤，基本不伸颈，当然斜颈就不明显了。但从SCM外观看，虽然没有斜颈，但造模三组SCM都比空白组略粗，说明仍然符合临床特征。(3)该病多为SCM先天发育不良，或产伤所致；前者与生俱来肌肉就短缩，后者损伤太早致该肌发育不良。而我们塑造的模型为正常家兔，SCM已基本发育成熟并对称，此时造模仅仅是在正常肌肉的某一节段上造成损伤，尤如一棵被划破了皮和部分木质的小树，因为没有影响到中轴(心)而不会倾斜一样，模型也就未见其斜颈了。针对以上问题，在以后CMT的模型研制过程中可以考虑选择非爬行动物，如灵长类的猴子与猩猩等；可以在更早的时间，如动物刚出生就造模；且其造模方法

要足以影响到肌肉中轴(心)，或整个节段。而对于其病理特征，同空白组相比，三种造模方法都不同程度地引发了局部纤维化，满足了肌性斜颈的基本病理改变。其实，动物模型和其要模拟的人类的真实状态总是有所差别的，如氢化考的松塑造阳虚和阴虚模型、频繁断尾塑造单纯性消化功能不良模型，和限制活动与冷水冲淋塑造慢性疲劳综合征模型等都与真实疾病有很大差别。造成差别的原因可能因为动物和人有本质区别，因为动物和人类疾病不完全互通，因为不少疾病的原因还未知(不知道其真实原因，当然就只有模拟其表象了)，还因为症状和体征本身并不具有特异性等。所以，在模型的研制过程中，人们更注重病理特征而不是症状和体征的塑造。从这一点上说，我们的造模是成功的。

6.2　三种造模方法比较　颈外静脉结扎法是目前所能见到的唯一报导的CMT造模方法。其机理在于结扎颈外静脉后SCM局部静脉回流障碍，最终使局部组织变性与坏死，并纤维化。但在预试中，我们发现这种方法造模效果并不理想，有些幼兔甚至完全无纤维增生。为此，我们探讨了新方法，而只将其设为对照组。从结果可见，它的造模效果确实较注射无水酒精差。无水酒精是临床常用的传统硬化剂，多用于肝癌、肾囊肿等疾病的治疗。其作用机理为无水酒精进入瘤体内，一方面直接使肿瘤细胞脱水，蛋白凝固，瘤体细胞变性坏死；另一方面血管内皮细胞脱水，血管闭塞，血供停止，也致肿瘤缺血坏死，最终局部纤维化。事实上，在任何组织内注入高浓度乙醇都可以发生类似现象。我们正是基于以上认识而选择无水酒精局部注射的。根据本研究结果，这种方法应该是可行的。消痔灵注射液为脏肠科治疗痔疮的硬化剂，其主要成分为明矾、三氯叔丁醇、甘油、鞣酸、低右等，具有收敛、止血、抗炎、修复等作用。其作用机理也在于注射后局部组织无菌性炎症，蛋白质凝固、血管腔闭塞，继发纤维组织增生。

三种造模方法比较，B组纤维增生程度较A、C两组明显，出现时间也较A、c两组早。其可能原因为：A属于机械原理造模。A组在结扎颈外静脉后，将要经历由静脉瘀血、组织间毛细血管淤血，发展至动脉供血障碍的过程；这一过程需要时间，同时由于静脉和动脉的侧枝循环，使结扎单一血管最终能否形成整个肌肉细胞的变性、坏死和纤维组织增生存在不确定性。这应该是最主要原因。本实验A组30天后的标本较15天后的阳性率高与谢宝珊等报导的第1个月病理改变不如第3个月相一致，说明这种方法复制CMT动物模型需要较长时间，且其病理变化复杂，不会在短期内呈现明显的纤维化特征。而B、C属于化学原理造模。因直接在局部注入化学药品，其对局部的腐蚀、烧灼、脱水等立即发生，组织细胞变性和坏死也很快发生(有人报导注入无水酒精5分钟内就可见到组织细胞蛋白凝固变性和坏死)，损伤组织的自我修复也相继进行，故其形成纤维化的时间短且明显。这是B、C两组15天模型阳性率高于A组的原因。无水酒精和消痔灵虽然同为硬化剂，其药理作用基本一致，即均导致局部组织脱水、变性、坏死和纤维组织增生，但因为消痔灵为混合物，其浓度远低于无水酒精，其对局部组织的刺激(损伤)强度较无水酒精小，局部肉芽组织增生不典型，成纤维细胞含量较少，故其病理变化不如B组明显。

综上所述，运用无水酒精造模具有时间短，纤维增生明显等特点，是一种简便可靠的塑造CMT病理模型的方法，值得推广。

6.3　病理检测指标的意义

6.3.1　HE病理检测：早在1893年，Taylor解剖了SCM肿块，发现正常肌肉组织被肌束间的纤维组织所替代而变成了白色(纤维组织的颜色)。Apple对SCM肿块进行针吸病理活检，发现肌纤维萎缩，部分细胞变性，被分隔成小岛状，其间被增生的纤维母细胞，纤维细胞及胶原纤维浸及，提出了间质增生及纤维化是该病的病理特征。Gonzales观察到在纤维增生的过程中，有时可见较多血管或增生的母细胞，个别区域有炎性浸润，表明纤维增生来自肉芽组织，是肌肉组织退变之后的一种修复反应。所以，HE病理检测是直观了解纤维化程度的指标。

6.3.2　α-SMA免疫组化检测：α-SMA是肌纤维母细胞细胞表型的标志性蛋白㈣。它反应了纤维母细胞的存在和含量。Kischerml等发现在局部缺血缺氧时，纤维母细胞将转化为肌纤维母细胞，并合成和释放大量胶原，从而引发局部纤维化发生。唐氏发现α-SMA在CMT中呈高表达率，而正常人的α-SMA却呈阴性表达，提示该指标对判断纤维化有意义。