肝胆管结石上皮Survivin及PCNA表达与肝胆管癌关系的研究

[摘要] 目的 探讨肝胆管结石上皮survivin及增殖细胞核抗原（pcna）表达与肝胆管癌之间的关系。方法 采集正常对照、肝胆管结石、肝胆管癌患者肝胆管组织，免疫组化法测定肝胆管上皮Survivin及PCNA表达阳性率。结果 正常对照、肝胆管结石、肝胆管癌患者肝胆管上皮Survivin表达阳性率分别为0、42.1%和70.0%。三组间两两比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。正常对照组PCNA阳性率为0，而肝胆管结石、肝胆管癌患者肝胆管上皮PCNA表达阳性率均为100%，强度为++或+++。其中肝胆管结石组的PCNA与病程长短和结石大小呈正相关，肝胆管癌组的Survivin和PCNA表达呈正相关（r＝0.701，P＜0.01）。结论 肝胆管结石上皮组织高表达Survivin及PCNA，提示肝胆管结石上皮有癌变倾向。

[关键词] Survivin；PCNA；肝胆管结石；肝胆管癌

[中图分类号] R735.8；R657.4 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2011）23-53-03

The Correlation between the Expression of Survivin and PCNA in Hepatobiliary Epithelium of Hepatolithiasis and Cholangiocarcinoma

ZHANG Miaozun1 LI Mingzhu1 GU Xin2

1.Department of Hepatobiliary Surgery, the People’s Hospital of Yinzhou, Ningbo 315040, China; 2.Department of Pathology, the People’s Hospital of Yinzhou, Ningbo 315040, China

[Abstract] Objective To estimate the correlation between the expression of survivin or PCNA in hepatobiliary epithelium of hepatolithiasis and cholangiocarcinoma. Methods The specimens of hepatobiliary tissue from the paitents of normal control, hepatolithiasis and cholangiocarcinoma were obtained during the surgeries. The expressions of survivin or PCNA were examined by immunohistochemistry. Results The positive expression rates of survivin were 0, 42.1% and 70.0% in control group, hepatolithiasis group and cholangiocarcinoma group respectively. The hepatolithiasis and cholangiocarcinoma groups had statistically higher rates of survivin than that of control group （P＜0.05）. And the rates in cholangiocarcinoma patients were significantly increased, compared to that in hepatolithiasis （P＜0.05）. Hepatobiliary tissue didn’t have PCNA expression in control group. However, the positive PCNA rates in hepatolithiasis and cholangiocarcinoma were both 100% with levels from ++ to +++. PCNA rates in hepatolithiasis were significantly associated with duration and diameter of calculus. A positive correlation was found between survivin and PCNA in cholangiocarcinoma group （r＝0.701，P＜0.01）. Conclusion Increasing expression of survivin and PCNA in hepatolithiasis indicates that the epithelium of hepatolithiasis has a high risk of developing cholangiocarcinoma.

[Key words] Survivin; PCNA; Hepatolithiasis; Cholangiocarcinoma

Survivin是凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis proteins，IAP）的成员，表达于细胞分裂期，具有抑制细胞凋亡、促进细胞增殖的作用，在癌症的发生及发展过程中起着重要的作用，是很多癌症的重要生物标志物之一。增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）是反映细胞增殖活性的重要指标，PCNA表达越多，则提示肿瘤细胞增殖越快。肝胆管癌生长缓慢隐蔽，临床上很难早期发现，往往以梗阻性黄疸为首发症状，术后复发性高，预后差。病理检查发现，肝胆管癌中心经常合并有结石的发生，因此我们推测，肝胆管癌的发病机制之一可能是肝胆管结石上皮的恶变与发展。本次研究通过对正常对照、肝胆管结石、肝胆管癌患者的肝胆管上皮细胞中Survivin及PCNA表达的研究，探讨Survivin及PCNA表达与肝胆管癌的关系，以期进行早期预测肝胆管结石患者肝胆管上皮癌变的可能性。

1 材料与方法

1.1 标本

所有标本取自本院2001年1月～2009年6月术后存档石蜡块。其中外伤性患者肝胆管上皮组织8例作为正常阴性对照，男6例，女2例，年龄24～57岁，平均41.2岁；肝胆管结石标本38例，男10例，女28例，年龄29～79岁，平均53.8岁，结石大小0.3～2.0cm，平均1.1cm，病程0.25～34年，平均10.7年；肝胆管癌标本20例，男13例，女7例，年龄43～67岁，平均55.3岁，临床分期Ⅰ～Ⅲ期，病理分化级别中或高度分化，60%合并结石。所有石蜡块标本进行4μm连续切片10张。

1.2 免疫组化染色

采用免疫组化S-P法，试剂盒[兔抗人Survivin或PCNA免疫组化多克隆抗体即用型、过氧化物酶标记的链霉卵白（SP）染色试剂盒，浓缩型二甲基联苯胺（DAB）试剂]购自福州迈新生物技术开发有限公司。操作步骤按试剂盒说明书进行。

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1.3 Survivin及PCNA免疫组化染色阳性分级

每张切片随机选10个高倍视野，每个视野计数100个细胞阳性细胞所占的百分比，分为4个等级：阳性细胞所占百分比＜5％为阴性（-）；阳性细胞所占百分比在6％～25％为弱阳性（+）；阳性细胞所占百分比在26％～50％为中等阳性（++）；阳性细胞所占百分比＞50％为强阳性（+++）[1]。

1.4 统计学方法

采用SPSS12.0进行数据的统计分析。阳性率的比较采用χ2检验或Fisher精确概率法，阳性率与临床特征关系的分析采用多元线性回归分析。

2 结果

2.1 Survivin免疫组化染色结果

正常组的8例样本中，未发现有Survivin阳性者。而肝胆管结石组和肝胆管癌组的阳性率分别为42.1%、70.0%（图1，图2），与正常组比较，阳性率升高明显，差异有统计学意义（P＝0.029、0.001）。肝胆管癌组的阳性率高于肝胆管结石组，差异有统计学意义（P＝0.043），见表1。本次研究未发现肝胆管结石组Survivin表达阳性率与患者性别、年龄、病程长短、胆管是否扩张以及结石直径等临床特征有统计学显著关系。

注：与正常组比较，*P＝0.029，**P＝0.001；与肝胆管结石组比较，#P＝0.043

2.2 PCNA免疫组化染色结果

本次研究未发现正常对照组肝胆管上皮有PCNA表达（阳性率为0），而肝胆管结石、肝胆管癌患者肝胆管上皮均表达PCNA（阳性率均为100%），强度为++或+++（图3，图4）。肝胆管结石组PCNA的表达与患者病程长短、结石直径呈显著正相关，相关系数r分别为0.024（P＜0.01）、0.370（P＜0.05）。

2.3 Survivin和PCNA关联性

肝胆管癌组Survivin和PCNA表达呈正相关（r=0.701，P＜0.01），而结石组两者间无相关关系（P＞0.05）。

3 讨论

癌症的发生、发展是一个多基因、多步骤、多阶段的过程[2]。近年来研究表明，Survivin是一种敏感性较高的肿瘤标志物，表达于肿瘤细胞，而正常终末分化细胞没有该蛋白的表达[3-5]。本次研究中，正常组织及肝胆管癌组织Survivin表达阳性率为0和70.0%，与国内外一些研究结果一致[6-8]。肝内胆管结石和肝胆管癌的发生密切相关，为绝大多数学者所共识，此次研究发现，肝胆结石组的阳性率接近50%，提示Survivin表达升高可能是肝胆管癌发生的早期事件，它可能在肝胆管癌的发生、发展中起到重要作用。近来，有学者提出用Survivin特异性siRNA来下调或阻断高药物抵抗性的A549/DDP癌细胞中高水平表达的Survivin[6]，MTT结果显示，癌细胞的IC50和药物抵抗性显著降低，提示Survivin基因敲除可以增加细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖以及提高肿瘤细胞对放疗和化疗的敏感度[9，10]。本研究和其他研究一样[11-13]未发现Survivin表达与肝胆结石或肝胆管癌患者的临床特征有关联，可能与样本数较少有关，有待增加样本量进行进一步研究。

PCNA与细胞周期中S期增殖有关，对DNA复制起重要作用，它与肿瘤分化程度、组织学分级等有密切关系[14]，多种癌症如肝癌、胃癌、肠癌、肺癌、乳腺癌等都有该蛋白的高表达[15-19]。本次研究中，所有肝胆管结石及肝胆管癌上皮PCNA表达均为阳性，阳性率为100%，表达强度为++～+++，提示本次研究中的肝胆管结石上皮有进一步恶变成肝胆管癌的高可能性。

总之，本次研究表明，肝胆管结石上皮组织高表达Survivin及PCNA，表明肝胆管结石上皮有癌变倾向，Survivin及PCNA等肿瘤相关蛋白表达的测定，可能成为预测慢性肝胆结石患者胆管上皮癌变风险的指标。

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（收稿日期：2011-04-25）

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