高效液相色谱法测定依达拉奉注射液中依达拉奉及有关物质的含量

[摘要] 目的 建立测定依达拉奉注射液中依达拉奉及有关物质含量的高效液相色谱法（HPLC）。 方法 采用Cromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢铵溶液（50：50）[用20%磷酸调节pH值至（3.5±0.1）]；流速：1.0 ml/min；检测波长：239 nm；柱温：30℃。 结果 在该色谱条件下，依达拉奉与样品中杂质可完全分离；在6.024～54.216 μg/ml 范围内，峰面积与其浓度线性关系良好（r = 0.9997，n = 5），平均回收率为100.34%（RSD = 0.55%，n = 9），最低检出量为12.1 ng。 结论 本法操作简便快速，准确可靠，专属性强，可用于依达拉奉注射液中依达拉奉及有关物质的测定。

[关键词] 依达拉奉；HPLC；含量测定；有关物质

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）07（c）-0061-04

依达拉奉（edaravone，3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮）为强效自由基清除剂，于2001年在日本上市，临床上主要用于治疗急性缺血性脑卒中[1]。作为第1个新型氧自由基清除剂，具有清除自由基、抑制脂质过氧化及减轻缺血脑细胞、血管内皮细胞、神经细胞的氧化和再灌注损伤的作用，并可阻止脑水肿和脑梗死进展，改善因急性脑梗死所致的神经症状、日常生活活动能力和功能障碍[2]。近年来，有关依达拉奉治疗肌萎缩侧索硬化症、帕金森病等的临床研究正在进行中，抗癫痫和抗类风湿性关节炎在临床实践中被发现，其对人类多种疾病的有效性说明此药具有广阔的开发前景[3]。本研究根据依达拉奉的结构特点和化学性质，参考相关文献[4-7]，建立了高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定依达拉奉注射液中依达拉奉及有关物质的含量，本方法能将供试品中主峰与有关物质峰完全分离，且能有效检出依达拉奉注射液中所含杂质，具有专属性强、灵敏度高、选择性好、简便、准确等特点，可有效地应用于依达拉奉注射液的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-15C高效液相色谱仪，SPD-15C紫外-可见光检测器（日本岛津公司），CTO-15C色谱柱柱温箱（日本岛津公司），Lcsolution 15C 工作站（日本岛津公司），SIL-10AF自动进样器（日本岛津公司）；UV-2450紫外分光光度计（日本岛津公司）、AUW120D 岛津分析天平。

1.2 试药

甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。依达拉奉对照品（批号：100620-200401；含量100%，中国药品生物制品检定所）；依达拉奉注射液（福寿堂制药有限公司；规格：20 ml∶30 mg；批号：110911、110913、110915）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件和系统适用性试验

色谱柱：Cromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢铵溶液（50∶50）[用20%磷酸调节pH值至（3.5±0.1）]；流速1.0 ml/min；检测波长：239 nm；柱温：30℃；进样量：20 μl[8-9]。

2.1.1 对照品溶液的制备

取依达拉奉对照品适量，精密称定，用流动相溶解并定量稀释制成每毫升中约含30 μg的溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备

精密量取依达拉奉注射液（批号：110911）2.0 ml，置100 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。

2.1.3 空白辅料溶液的制备

按处方制备不含依达拉奉的溶液。取空白辅料溶液2.0 ml，置100 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。

2.1.4 系统适用性试验

在上述色谱条件下，分别精密吸取空白辅料溶液、依达拉奉对照品溶液及依达拉奉供试品溶液各20 μl进样。理论板数以依达拉奉峰计算应不低于1000。结果提示，理论板数以依达拉奉峰计为2500，空白辅料对测定无干扰（图1）。

2.2 破坏性试验

在杂质或降解产物不能获得的情况下，对本品进行酸、碱、热、光、氧强制降解试验。

2.2.1 样品的制备

2.2.1.1 破坏前样品的制备 精密量取110911批次的依达拉奉注射液2.0 ml，置10 ml量瓶内，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.2.1.2 酸破坏样品的制备 精密量取依达拉奉注射液2.0 ml，置10 ml量瓶内，加入0.1 mol/L的盐酸溶液2 ml，室温下静置4 h后，加0.1 mol/L的氢氧化钠溶液适量中和，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.2.1.3 碱破坏样品的制备 精密量取110911批次的依达拉奉注射液2.0 ml，置10 ml量瓶内，加入0.1 mol/L的氢氧化钠溶液2 ml，室温下静置4 h后，加适量0.1 mol/L的盐酸溶液中和，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.2.1.4 热高温破坏样品的制备 精密量取110911批次的依达拉奉注射液2.0 ml，置10 ml量瓶内，150℃高温加热1 h后取出，放至室温，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.2.1.5 光照破坏样品的制备 精密量取110911批次的依达拉奉注射液2.0 ml，置10 ml量瓶内，用流动相稀释至刻度，在强光（4500±500） Lx下放置4 h后，摇匀，滤过，即得。

2.2.1.6 氧化破坏样品的制备 精密量取110911批次的依达拉奉注射液2.0 ml，置10 ml量瓶内，加入10%的过氧化氢2 ml，室温放置2 h，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

精密量取上述样品溶液各20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。

2.2.2 破坏性试验的结果

本品在酸、碱、热条件下较稳定，但是在氧化和光条件下有明显的降解产物生成。本品溶液在酸、碱、氧化、光照及高温条件下进行破坏所产生杂质在本色谱条件下均能与依达拉奉良好分离，因此可以采用上述色谱条件测定本品的有关物质（图2）。

2.3 线性关系考察

取依达拉奉对照品，精密称定，置容量瓶中，加流动相溶解使成约0.3 mg/ml溶液，作为贮备溶液。分别精密量取上述贮备溶液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 ml置入50 ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度。精密量取上述溶液各20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图及峰面积。以溶液浓度（X）为横坐标，以相应峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，回归方程Y = 151 629X+839 53（r = 0.9997）。结果提示，依达拉奉溶液在6.024～54.216 μg/ml范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.4 检出限

取依达拉奉对照品溶液（0.3 mg/ml），用流动相进行逐级稀释，按“2.1”项下色谱条件进样20 μl，以信噪比为3∶1的进样浓度为最低检出限，依达拉奉溶液的最低检出限为12.1 ng/ml。

2.5 精密度试验

精密量取110911批次的依达拉奉注射液2.0 ml，置100 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取上述样品溶液各20 μl，连续测定6次，记录各次测定的主成分峰面积，按峰面积计算，RSD值为0.64%，表明本方法进样精密度良好。

2.6 稳定性试验

取“2.5”项下供试品溶液，分别于0、1、2、4、6、8、12 h内进样测定，记录色谱图及峰面积，结果提示，供试品的峰面积稳定性良好，按峰面积计算，RSD值为0.81%，表明本品溶液在室温下放置12 h内稳定。

2.7 重复性试验

取110911批次的依达拉奉注射液，按“2.1”项下供试品及对照品溶液制备方法，配制6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，按外标法计算供试品的含量，结果提示，6份样品溶液的平均标示含量为100.2%，RSD值为0.90%，表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密量取9份已知含量的依达拉奉注射液（批号：110911；依达拉奉含量为1.503 mg/ml），每份为1.0 ml，置入100 ml量瓶中，分别精密加入依达拉奉对照品溶液（1.01 mg/ml）1.0、1.5、2.0 ml，按供试品溶液制备方法制备成高、中、低3个浓度的溶液，各3份，按“2.1”项下方法进样测定，计算回收率。结果提示，平均回收率为100.34%（n = 9），RSD值为0.55%，表明本方法准确度良好（表1）。

表1 加样回收率试验（n = 9）

2.9 供试品含量及有关物质的测定

2.9.1 供试品含量的测定

取3批依达拉奉注射液（批号：110911、110913、110915），按“2.1.1”及“2.1.2”项下方法制备对照品溶液和供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，按外标法以峰面积计算样品中依达拉奉的含量。结果提示，3批依达拉奉注射液所含依达拉奉的含量分别为1.503 mg/ml（占标示量的100.2%）、1.505 mg/ml（占标示量的100.3%）、1.500 mg/ml（占标示量的100.0%）。

2.9.2 有关物质的测定

取3批依达拉奉注射液（批号：110911、110913、110915），分别精密量取样品2.0 ml（约相当于依达拉奉3 mg），置10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1.0 ml，置100 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。按“2.1”项下条件，取对照溶液20 μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的10%～30%；再精密量取对照品溶液及供试品溶液各20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分色谱峰保留时间的3倍，按不加校正因子主成分自身对照法计算供试品溶液中有关物质的含量。结果提示，3批依达拉奉注射液的有关物质含量分别为0.17%、0.18%、0.18%。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

取依达拉奉对照品溶液（约30 μg/ml）及空白辅料溶液（按处方比例配制），在200～500 nm波长范围内依法进行紫外扫描，结果表明依达拉奉在239 nm的波长处有最大吸收，而辅料在239 nm处无吸收，因而选择239 nm作为依达拉奉的检测波长。

3.2 流动相的选择

本研究考察了甲醇-乙酸铵、甲醇-磷酸二氢铵两种流动相系统，结果提示，依达拉奉在两种流动相系统下峰形均良好，但是后者效果更佳，且出峰时间适宜。进一步考察甲醇和磷酸二氢铵溶液的比例，研究表明，采用甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢铵溶液（50∶50）[用20%磷酸调节pH值至（3.5±0.1）]为流动相，能够有效地检测出依达拉奉注射液中所含的有关物质。

3.3 流动相pH的选择

流动相的pH值对依达拉奉峰的出峰时间和峰形影响不大，但是影响依达拉奉与其降解杂质的分离效果，本研究将流动相的pH值调节至（3.5±0.1），依达拉奉与其降解杂质能够较好地分离。

本研究在相关文献[4-7]和制剂工艺研究的基础上，对依达拉奉注射液中依达拉奉和有关物质的含量进行了质量研究工作，采用HPLC进行了空白辅料干扰试验、破坏性试验、精密度试验、回收率试验等方法学验证工作，证明本研究建立的有关物质检查和含量测定的方法适用于依达拉奉注射液的质量监控。

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（收稿日期：2013-04-17 本文编辑：袁 成）