新疆红肉苹果PGIP基因的克隆及原核表达

摘 要： 【目的】研究克隆新疆红肉苹果 [Malus sieversii f. neidzwetzkyana（Dieck） Langenf] pgip基因并进行原核表达，探讨其抗病机制。【方法】根据Genbank 中已经发表的‘金冠’苹果PGIP保守区域设计1对特异引物，以新疆红肉苹果叶片总RNA为模板，T/A克隆后进行序列测定，并对该序列进行分析。随后将该蛋白成熟肽cDN段连接到原核表达载体pET30a（+）中，构建融合表达质粒，转化到E. coli BL21（DE3）中进行表达。【结果】序列分析表明，新疆红肉苹果PGIP基因cDNA编码区全长993 bp，编码330 个氨基酸残基，命名为MsPgip，GenBank登录号为JQ001783。MsPgip分子质量为36.6 kD，等电点为7.05，有6个潜在的N-糖基化位点，信号肽为N端24个氨基酸残基。该蛋白质还具有2个连续的24个氨基酸残基大小的LRR基序（LSQLKNLTFLDLSFNNLTGAIPSSLSQ LPNLNALHLDRNKLTGHIPIS）。与已克隆的‘澳洲青苹’、‘金冠’、‘富士’苹果PGIP氨基酸序列同源性均高达99%。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明，表达蛋白的分子质量与预期一致。【结论】克隆了新疆红肉苹果PGIP基因，并可在大肠杆菌中表达。

关键词： 新疆红肉苹果； 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白； 基因克隆； 表达

中图分类号：S661.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪01-0001-07

探讨病害形成及抗病机理、培育抗病品种是果树病害科学防控最经济有效的途径之一。我国北方落叶果树常见的真菌性病害主要有轮纹病、腐烂病、炭疽病、白粉病、黑星病等，这些病害不仅危害果树的根、茎、叶，也危害果实[1]。真菌入侵植物时，必须首先穿越植物细胞壁，以启动和扩大感染，真菌可分泌一系列的酶来降解植物细胞壁，而内切多聚半乳糖醛酸酶（Endo-polygalacturonases，Endo-PGs）是真菌首先分泌的细胞壁降解酶。植物产生的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（polygalacturonase-inhibiting proteins，PGIPs）能够与病原菌的PGs专一、可逆的结合，形成一种高亲和复合物，从而抑制病原菌PGs的活性，并使具有生物活性的寡聚半乳糖醛酸苷（oligogalacturonides，OGs）的稳定期相对延长，从而引发多种防卫反应，增强植物抗性[2]。

新疆野苹果（或塞威士苹果，Malus sieversii Roeml）为伊犁野果林的建群种，是第三纪孑遗物种，同时也是现代栽培苹果（Malus domestica Borkhl）的祖先种，十分珍贵[3]。尽管国家已在伊犁地区建立了新疆野苹果自然保护区，但由于农田开发及过度放牧等原因，导致新疆野苹果资源正遭到严重破坏，群落面积急剧减少，保护这一宝贵种质资源迫在眉睫。为此，本课题组在对新疆野苹果形态、化学成分（糖、酸及香味与酚类物质组分以及矿质元素含量等）、分子系统学等多个层面进行了系统评价的基础上，研究建立了核心种质构建及离体超低温保存技术体系，构建了新疆红肉苹果与‘红富士’等栽培苹果品种杂种F1分离群体，已定植杂种实生苗4万余株，研究发现，新疆野苹果在表型与分子层面均存在丰富的遗传多样性，是进行苹果功能成分育种的重要基因库，并已从F1群体中选育出一批功能成分含量高的红肉苹果新品系[4-6]；胡小平等[7-8]对苹果种质资源抗黑星病特性进行的鉴定结果表明，15个参试苹果种质可被划分高度抗病、中度抗病、中度感病及高度感病4种类型，其中新疆野苹果和‘秦冠’为高度抗病品种，其抗病性表现在抗侵入和抗扩展两个方面，但有关新疆野苹果抗病的分子机理至今未见研究报道。为此，我们以新疆红肉苹果为材料，进行PGIP基因的克隆及原核表达，旨在为进一步的苹果抗病分子机理研究提供基本资料，并为新疆野苹果资源的有效保护与利用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试材

试验于2010—2011年在山东农业大学作物生物学国家重点实验室和山东农业大学泰安横岭果树育种基地进行，供试材料为新疆红肉苹果（Malus sieversii f. neidzwetzkyana）‘夏红肉’4 a生嫁接苗，取新鲜叶片带回实验室，-70 ℃冰箱保存备用。

1.2 RNA的提取和cDNA第1链的合成

以新疆红肉苹果新鲜幼叶为材料，采用大连宝生物公司的Trizol试剂提取该组织总RNA，进行RNA质量和浓度检测后取1 μg的总RNA用于cDNA第1链的合成。

1.3 引物设计

根据GenBank中公布的‘金冠’苹果PGIP基因的保守序列和原核表达载体pET30a（+）多克隆酶切位点，设计特异引物。MsPgip-F： 5′-CTGGATCC ATGGAACTCAACT-CAAGTTCTCC-3′，MsPgip-R： 5′-TTGTCGACTTACTTGCAGCTTGGGAG-3′。在上下游引物的5′端分别加入BamHⅠ和SalⅠ酶切位点及保护碱基（下划线部分为酶切位点，斜体部分为保护碱基）。

1.4 PGIP基因的克隆

参照大连宝生物公司的RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0试剂盒说明书合成cDNA第1链。

以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR条件： 94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，48 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。参照索来宝多功能凝胶回收试剂盒说明书回收PCR产物。回收产物与pMD18-T-simple载体连接，转化E. coli DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，PCR确认后送至上海生工生物技术有限公司测序。重组质粒命名为pMD-MsPgip。

1.5 生物信息学分析

利用NCBI网站上的BLASTn程序进行同源序列比对；DNAMAN软件分析ORF，推导氨基酸序列，预测蛋白质分子质量、等电点、亲水性与疏水性，构建系统进化树；SignalP 3.0Server预测信号肽。

1.6 MsPgip基因在大肠杆菌中的表达

根据克隆的MsPgip序列以及原核表达载体pET30a（+）多克隆酶切位点序列，用BamHⅠ和SalⅠ双酶切重组质粒pMD-MsPgip和原核表达载体pET30a（+），分别回收插入的目的片段和表达载体，将2者按照摩尔比1∶3混合后，经T4 DNA连接酶连接后转化E. coli DH5α感受态细胞，随机挑取阳性克隆测序。同时，依照北京索来宝科技有限公司的DNA质粒小提试剂盒说明书进行提取质粒DNA，然后进行酶切鉴定。融合表达重组质粒命名为pET-MsPgip。

重组质粒pET-MsPgip转化E. coli BL21（DE3）感受态细胞，挑取抗性单菌落接种于2 mL液体LB培养基（含100 mg·L-1卡那霉素）37 ℃振荡培养过夜。次日以1∶100的比例转接到新的液体LB培养基中（含100 mg·L-1卡那霉素）37 ℃振荡培养2 h（OD600大约为0.5），随后加入异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导剂（终浓度0.2、0.4、0.6、0.8、1 mmol·L-1）进行诱导表达。同时以pET-30a（+）质粒转化菌加IPTG（终浓度1 mmol·L-1）诱导为正对照，以未加IPTG诱导的重组质粒为负对照。诱导2 h后收集菌体。菌体中加入菌液体积10%的1×SDS-PAGE 上样缓冲液（50 mmol·L-1 Tris-HCl（pH 6.8），2% SDS， 0.1%溴酚蓝，10%甘油，1% DDT），100 ℃煮沸5 min，立即冰浴2 min，最大转速离心5 min，取20 μL样品（即为总蛋白）上样，进行SDS-PAGE（5%浓缩胶和10%分离胶）电泳分析。凝胶用考马斯亮蓝R-250染色并脱色至背景清晰。

2 结果与分析

2.1 MsPgip的克隆和序列分析

以红肉苹果叶片cDNA为模板进行RT-PCR，获得了预期大小的单一条带。将该片段连接到pMD18-T-simple载体后测序，结果表明，该基因的读码框（ORF）为993 bp。命名为MsPgip，GenBank登录号为JQ001783。MsPgip基因编码330个氨基酸（图1）。其中，酸性氨基酸32个，占9.7%，碱性氨基酸32个，占9.7%。分子质量约为36.6 kD，等电点为7.05。将该基因编码的氨基酸序列分别采用隐马尔科夫模型和神经网络方式进行信号肽预测， 结果均表明该蛋白质信号肽为N端的24个氨基酸残基，蛋白质裂解点位于第24位丝氨酸（ Ser） 与第25位天冬氨酸（ Asp） 残基之间。蛋白质亲水性和疏水性分析表明，该蛋白质N 端24 个氨基酸残基构成一明显的疏水区域，这与信号肽预测结果相吻合。此外，其N端含有6个潜在的糖基化位点，N端和C端分别含有5个、4个参与二硫键形成的半胱氨酸残基。序列保守性分析发现，该蛋白质还具有2个连续的24个氨基酸长的LRR基序 （LSQLKNLTFLDLS FNNLTGAIPSSLSQLPNLNALHLDRNKLTGHIPIS）。这是多数植物抗病基因PGIP表达蛋白特有的保守序列。

2.2 MsPgip同其他PGIPs的比较

将MsPgip与GenBank中登陆的其他PGIPs基因氨基酸序列进行比对，构建系统进化树（图2）。结果显示，MsPgip同蔷薇科类PGIPs具有很高的同源性，如： 与桃84%、美洲李85%、湖北海棠97%、西洋梨98%。从进化关系来看，新疆红肉苹果同‘澳洲青苹’、‘金冠’、‘富士’、湖北海棠、西洋梨聚在一起，同玉米、大豆、拟南芥关系甚远。

MsPgip与‘澳洲青苹’、‘富士’、‘金冠’PGIP的氨基酸序列同源性均高达99%，只有3个氨基酸不同（图3）。‘澳洲青苹’、‘富士’、‘金冠’氨基酸序列第7、185、218位点分别是I（异亮氨酸）、K（赖氨酸）、T（苏氨酸），而新疆红肉苹果氨基酸序列第7、185、218位点分别是T（苏氨酸）、I（异亮氨酸）、G（甘氨酸）。

2.3 MsPgip在大肠杆菌中的表达

2.3.1 重组质粒的构建及重组子的鉴定 提取pMD-MsPgip和pET30a（+）质粒，同时用BamHⅠ和SalⅠ双酶切，回收插入片段和表达载体，将2者按照摩尔比1∶3混合后，用T4 连接酶进行连接，构建重组质粒pET-MsPgip。用BamHⅠ和SalⅠ双酶切重组质粒pET-MsPgip，可切出1 000 bp左右片段。为了进一步证明重组质粒构建正确，在酶切鉴定的基础上，对重组表达质粒pET-MsPgip进行了序列测定。序列测定结果表明，连入表达载体pET30a（+）中的基因片段与目的序列一致，并且酶切位点连接处序列也正确，未出现碱基突变及移码现象。表明已获得了正确的MsPgip的原核表达重组质粒。

2.3.2 SDS-PAGE分析 重组质粒pET-MsPgip在大肠杆菌BL21（DE3）中通过IPTG诱导融合表达。结果表明，在37.6 kD（含标签大小）左右位置有目的蛋白的融合表达条带（图4），表达的融合蛋白分子量大小与理论预测值相符，而正负对照在37.6 kD左右均未有表达，这说明融合蛋白在E. coli BL21（DE3）中成功表达。

经过不同浓度IPTG诱导培养后，目的融合蛋白在不同浓度下表达量变化没有显著差异。表明 IPTG 浓度对融合表达载体pET-MsPgip表达水平影响不大。

3 讨 论

提质增效是我国苹果产业的主旋律，围绕这一主题，一方面要进一步加强品质育种，同时要瞄准国际苹果产业发展前沿，研究建立适应中国国情的现代苹果栽培模式，即良种与良法配套[4]。选育并推广抗病苹果品种，可有效减少农药的使用量，是提质增效的重要途径之一；已有的研究结果表明，新疆野苹果不仅富含多酚等功能成分，是进行苹果功能成分育种的重要基因库，而且高抗苹果黑星病[5，7]。为此，进一步开展新疆野苹果抗病分子机理研究，创制优质抗病苹果新品种，对于新疆野苹果这一珍贵资源的科学保护与有效利用以及我国苹果产业的优质高效发展具有重要意义。

植物PGIP与病原真菌PGs相互作用是从分子水平上研究植物LRR介导特异识别的一种模式系统，而LRR是大多数植物抗病基因PGIP表达蛋白特有的重复序列[9]。PGIP通过LRR基序上暴露于外表面的氨基酸残基来发挥其抑制PGs活性的作用[10]，这些暴露于外表面的氨基酸残基发生突变则会严重影响其活性[11]；在果树方面，目前已从梅、桃以及‘澳洲青苹’、‘金冠’与‘富士’苹果品种中克隆得到了PGIP基因[12-14]，其中从3个苹果品种中克隆得到的PGIP基因cDNA编码区全长均为993 bp，编码330个氨基酸残基，都含有2个连续的24个氨基酸残基大小的LRR基序。本研究以新疆红肉苹果为材料，从新鲜幼叶中克隆得到其PGIP基因。序列分析表明，新疆红肉苹果PGIP基因cDNA编码区全长993 bp，编码330个氨基酸残基。蛋白质分子质量为36.6 kD，等电点为7.05，有6个潜在的N-糖基化位点，信号肽为N端24个氨基酸残基。该蛋白质还具有2个连续的24个氨基酸残基大小的LRR基序。将本实验克隆得到的新疆红肉苹果的PGIP氨基酸序列同‘澳洲青苹’、‘金冠’与‘富士’苹果的PGIP氨基酸序列比较发现，4者在139～186位点都含有2个连续的24个氨基酸长的LRR基序，所不同的是第185位点氨基酸残基发生了突变，新疆红肉苹果为异亮氨酸（I），其他3个品种为赖氨酸（K）。新疆野苹果是现代栽培苹果的祖先种，在长期的进化过程中，3个栽培品种PGIP氨基酸序列在同一位置的突变导致PGIP活性发生了变化，抑制PGs能力下降，从而对黑星病的抗性降低。因此推测PGIP第185位氨基酸突变是导致‘澳洲青苹’、‘金冠’与‘富士’苹果抗黑星病的能力下降以及新疆野苹果对黑星病具有最高抗性的可能原因，有待进一步研究。

有研究表明，不同来源的PGIP其抑菌效果存在差异[15]，因此，在通过转PGIP基因进行植物抗病育种前有必要进行体外抑菌试验，大肠杆菌是最常用的外源基因表达宿主。本研究中MsPgip在大肠杆菌中成功表达，但其可溶性及抑菌效果如何有待验证。因此有必要将得到的原核表达蛋白进行分离纯化，进一步验证其抑菌效果并进行真核生物表达研究，以便为苹果抗病育种奠定基础。

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