造血干细胞范文
时间：2023-11-13 21:05:53
造血干细胞篇1
大家好!
我叫xx，来自xxx，是xx的18届毕业生，也是此次造血干细胞的志愿捐献者。首先感谢在场的各位领导和朋友们对我的关心和支持，而今能有这样的珍贵的机会去挽救他人的生命，我感到无比地幸运与自豪。
鲁迅先生曾说过：愿中国青年都摆脱冷气，只是向上走，不必听自暴自弃者流的话。能做事的做事，能发声的发声。有一分热，发一分光，就令萤火一般，也可以在黑暗里发一点光，不必等候炬火。以这段话作为座右铭的我每年生日都会去献血，至今已累计1200毫升，同时大四的时候为了庆祝大学毕业留了血样并加入中华骨髓库。2018年播种，3年之后终于等来了机会，端午节期间，我接到市红十字会的电话，有一名血液病的患者和我预留的造血干细胞初配型成功，问我是否意愿捐献？当时我就毫不犹豫的同意了，这是多么荣幸的事情啊，很多志愿者的血样在中华骨髓库里存放十几年都未必有机会捐献，这都是多么有纪念意义的事啊。
作为一名学生，我一直聆听老师的教诲、热心公益，心怀爱与善念，谨记刚毅厚重、永承重载的理工精神。如果能在自己力所能及的范围内帮到别人，那我一定会义无反顾的去做。我活在一个很好的时代，我始终认为在社会中你所遇到的善意远远多于恶意，我愿意把仁爱之心、无私奉献这样的中华美德传承下去。为社会奉献绵薄之力的同时，也让自己实现了人生价值。
生命无价，人心有情。造血干细胞移植是拯救白血病患者最有效的方法，是患者生存的一线希望。造血干细胞的捐献与献血并无区别，需要的只是捐献者的爱心与信心。我也希望能通过我的实际捐献，带动更多的人加入到造血干细胞志愿者的行列来，为更多的患者带来生命的希望。
在此，我要感谢红十字会给我提供这么一个帮助他人、服务社会的机会，感谢学校对我的培养、感谢老师对我的关心和帮助、感谢公司同仁门的支持。我将这次捐献之旅，做为我一生最美好的回忆珍藏。
最后，祝福未曾谋面的患者朋友，希望他能够早日康复!也祝愿各位领导身体健康，万事如意。
造血干细胞篇2
【关键词】 慢性粒细胞性白血病，心理问题，心理干预
造血干细胞移植作为一项治疗白血病及免疫性，遗传性疾病现代医学技术，为越来越多患者提供生存的机会。但是同时也给患者带来一系列心理压力[1]。造成许多心理问题，直接影响移植的顺利进行和疾病的康复。因此，观察了解患者的心理问题，做好心理护理尤其重要，现将体会介绍如下。
1. 临床资料
我科2001年7月至2007年8月期间，行造血干细胞移植35例，其中男29例，女6例，年龄15々49岁，中位年龄33岁，确诊为慢性粒细胞性白血病。
2. 产生心理问题的原因分析及护理对策。
2．1 环境因素。因慢性粒细胞性白血病患者与其他白血患者不同，一般是在家里口服药物治疗，对医院来说相对是一个比较陌生的环境，尤其患者移植是在一个与外界隔离，空间小，饮食活动受限，要求无菌条件的层流洁净室内，患者一时难以适应环境，容易产生焦虑，恐惧感，因而护理人员在患者入舱前，要提前让患者了解，观看层流室，让患者心中有数，同时，熟悉层流室护理人员，向患者介绍层流室环境，告知患者在层流室仍可以与家人朋友通过可视窗口见面，运用对讲系统与家人交流，室内有电视,可转移注意力, 减轻不适.
2.2乐观期待心理。许多患者在移植前，容易产生乐观期待心理，认为造血干细胞移植后生成是不成问题。此时，应反复向患者说明移植的全过程，大剂量化疗后产生的后遗症，疾病复发的可能，以及移植后引起的移植物抗宿主病。让患者对移植有一个清晰的认识，使患者有心理准备应对移植过程带来的痛苦，并让移植后长期存活的患者介绍亲身经历，告知痛苦是暂时的，是每位移植患者都要面对的现实，只要以顽强的意志和毅力配合治疗，才能战胜疾病。
2.3移植相关并发症：预处理和干细胞移植后，患者出现出血，发热，恶心，呕吐，腹痛，腹泻，口腔溃疡这些躯体痛苦极易导致患者的恐惧心理。因此，在移植前向患者详细介绍，并告知患者应对措施，如注意休息，少食多餐，加强含漱等，可以帮助减轻并发症，减少痛苦。
3. 小结
造血干细胞移植是慢性粒细胞性白血病患者治愈的希望，移植过程可能产生各种并发症，会引起患者的各种心理问题，直接影响到移植的顺利进行，因此在移植前应积极主动与患者进行交流，善于观察，及时发现患者的心理动态，有的放矢，减轻或消除其焦虑，恐惧心理，以轻松的心情迎接移植，确保移植顺利进行，使疾痛康复。
参考文献
造血干细胞篇3
【摘要】 目的 探讨经自体外周造血干细胞移植治疗急性单核细胞白血病的疗效。方法 1例14岁急性单核细胞白血病患者接受自体外周造血干细胞移植。采用粒细胞集落刺激因子（g-scf）动员外周血干细胞, 预处理选用环磷酰胺（ctx）和马利兰(myleran)。0天回输单个核细胞。观察症状体征变化及造血重建情况。结果 动员获得单核细胞数为4.98×108/kg, +12d粒系植入, +16d巨核系植入。结论 自体外周造血干细胞移植治疗急性单核细胞白血病有效。
【关键词】 自体造血干细胞移植 急性单核细胞白血病
急性白血病是造血组织中某一血细胞系统过渡增生，侵润到各组织器官，从而引起一系列临床表现的恶性血液病。造血干细胞移植是至今为止治疗血液系统恶性疾病最有效的方法之一,也是目前唯一可能根治多种血液恶性疾病如白血病的治疗手段。我院于2010年7月为1例急性单核细胞白血病患者进行自体外周造血干细胞移植, 目前移植后18d, 效果良好, 现报告如下。
1 资料和方法
1.1病例资料 患者，女，14岁。主因“确诊急性单核细胞白血病10月”入我院，患者于2009年10月因发热、关节疼痛，查血常规 wbc 24×109/l、血红蛋白 85g/l、血小板 20×109/l，骨髓象示急性单核细胞白血病。给予da方案化疗4次，症状消失，血常规及骨髓象均获完全缓解。
1.2 自体外周造血干细胞动员、采集与纯化 给予粒细胞集落刺激因子(g-csf)150ug×5d后，用cs-3000血细胞分离机采集外周血，每次分离12000ml外周血，得单个核细胞3.24×1010个，将其置于10%二巯基乙醇、20%人血白蛋白、70% imdm保养液中，于-196℃液氮中冻存。
1.3 具体方案 我院采用bycu方案：myleran 1mg/(kg·d)×4d, d-8～d-5，ctx 60 mg/(kg·d) ×2d, d-4～d-3，于0 天回输自体外周造血干细胞, 回输单个核细胞数4.98×108/kg。细胞活性为92.3%。
1.4 支持治疗 预处理同时给予水化碱化及美司钠预防出血性膀胱炎，止吐、镇静、保肝、营养心肌等支持治疗。移植后给予静脉营养、浓缩红细胞悬液和单采血小板等支持治疗。
2 结果
2.1 造血重建 患者于移植后+3d外周血白细胞降至0.13×109/l, 持续3天，移植后12d 外周血白细胞1.14×109/l、中性粒细胞0.61×109/l，中性粒细胞植入(>0.5×109/l) , 16d血小板39×109/l，血小板植入(>30×109/l),脱离红细胞和血小板输注。
2.2 预处理后不良反应及应对 移植前-3d～-1d, 患者心率100-125次/分，移植后+9d～+14d心率100-110次/分，考虑为环磷酰胺副作用及贫血所致，给予营养心肌及输血治疗后好转。患者于移植后+9d口腔黏膜出现溃疡，给予口泰、碳酸氢钠、碘甘油、雾化吸入交替局部治疗，3天后溃疡愈合。患者未出现发热、出血性膀胱炎等不良反应。
3 讨论
造血干细胞移植（hsct）是对骨髓功能摧毁或原发缺陷的患者静脉输注造血干、祖细胞以重建骨髓功能的一种治疗手段。自体外周血干细胞(pbsc)是骨髓造血重建重要的干细胞来源。其主要具有以下优点：（1）无供者来源问题；（2）无移植物抗宿主病，并发症少，移植相关死亡率低；（3）费用较低。
近年来, aml预后得到显著改善。目前按细胞遗传学特性将aml分为高、中、低危三组。aml中的低危组,预后良好,不必在第一次完全缓解（cr1）期移植,可在复发或第二次完全缓解（cr2）期时进行移植；aml中的高危组, 化疗的长生存率很低, 应尽早在cr1期移植；aml染色体核型正常者,为中危组,亦推荐在cr1期进行造血干细胞移植。对1或2个疗程诱导不能完全缓解的aml患者,也应尽早进行造血干细胞移植。aml患者在cr1后,经适当巩固强化治疗如无hla匹配同胞供者,应争取行auto-hsct。
结合上述理论，我院对该患者进行了自体外周血干细胞移植，预处理bucy方案选择恰当，且通过积极全面的支持治疗，未出现化疗后不良反应。移植后的造血恢复良好, 粒系于移植后12d植入, 巨核系于移植后16d植入。通过本例移植，我们认为，在aml患者身体状况良好，无明显心肝肾等疾病，且无hla配型相合供者的情况下，可考虑自体干细胞移植，这给部分aml患者提供了一个新的治疗方案。
参 考 文 献
[1] 徐岚,胡炯,等.造血干细胞移植治疗血液恶性肿瘤的生存分析 [j].肿瘤,2007,27(4):312.
造血干细胞篇4
[关键词] 造血干细胞；血液病；护理；移植；术前
[中图分类号] R457.7 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2015）05（c）-0141-03
[Abstract] Objective To discuss the preoperative nursing for patients undergoing hematopoietic stem cell transplantation so as to provide a reference for clinical nursing in the future. Methods 100 cases underwent hematopoietic stem cell transplantation admitted from February 2012 to September 2014 were selected and divided into the observation group and the control group with 50 cases in each in accordance with the random grouping method. The observation group were given the comprehensive preoperative nursing， while the control group were given the conventional preoperative nursing. And the status of nursing was compared between the two groups. Results After clinical nursing， the clinical situation of the observation group was much better than that of the control group. The incidence of complications was 46.0% in the observation group， and 74.0% in the control group， with a statistically significant difference（P
[Key words] Hematopoietic stem cells； Blood disease； Nursing； Transplantation； Preoperative
从临床上来讲，造血干细胞移植的机制是经过超大剂量的化疗处理或者放疗预处理较强的抑制患者的骨髓造血功能和身体免疫功能，并将正常的造血干细胞，利用一些手段植入到患者的体内，从而实现重建正常造血和免疫功能的目的。造血干细胞移植，是目前治疗恶性血液疾病的有效方法之一，但成功率并不是很高，很多患者在术后都会出现不同程度的并发症，甚至是排异反应。为此，通过对造血干细胞移植病人进行术前护理，加强准备工作，促使手术更加顺利，并且减轻患者所受到的病痛。该研究在2012年2月―2014年9月期间主要对造血干细胞移植病人的术前护理进行研究分析，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
随机选取2012年2月―2014年9月收治的造血干细胞移植患者100例为研究对象，随机分为观察组和对照组，每组50例。观察组：男性26例，女性24例；患者年龄在15～48岁之间，平均年龄为（32.6±2.6）岁；其中包括11例急性粒细胞白血病患者，14例急性淋巴细胞白血病患者，15例慢性粒细胞白血病患者以及10例急性再生障碍性贫血患者。对照组：27例男性患者，23例女性患者；患者年龄在16～49岁之间，平均年龄（32.5±2.7）岁；其中包括12例急性粒细胞白血病病患，13例急性淋巴细胞白血病病患，19例慢性粒细胞白血病病患以及6例急性再生障碍性贫血病患。比较两组患者的一般资料差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 方法
观察组患者实施综合性的术前护理，对照组患者实施常规术前护理，比较两组患者的护理效果。
1.2.1 观察组 首先，术前护理措施：患者行术前体检于术前1个月，将体表、重大脏器是否存在感染灶排除，若无异常感染则进行移植准备[1]；清洁肠道于入室前3 d，并配合服用制霉菌素、氟哌酸等肠道抗生素[2]；交待患者注意个人卫生，于三餐后或睡前应用口泰及碳酸氢钠交替漱口，并用1：5 000高锰酸钾液于便后坐浴[3]。注意防寒保暖，避免受凉[4]。其次，患者入室后护理：入室当天用1：5 000洗必泰液对全身皮肤进行药浴，从第2天起用1：2 000洗必泰液每天全身擦浴[5]；强化五官护理，五官护理中用的是阿昔洛韦滴眼液和诺氟沙星滴眼液交替滴眼，复方呋喃西林滴鼻液和复方薄荷脑滴鼻液交替滴鼻腔，VitE涂抹嘴唇，餐后进行口腔护理，4次/d[6]；实施中心静脉插管在入室后第1天，严格执行无菌流程，换药1次/d，仔细留意穿刺处皮肤的变化[7]。最后，当患者呕吐时嘱其头偏向一侧进行呕吐，避免吸入性肺炎的发生，若有异常现象，及时向医生报道[8]。
1.2.2 对照组 第一，向患者讲解必要的医疗知识，降低患者的恐惧[9]。第二，对患者实施必要的护理干预，尽量减轻患者的生理负担。第三，严密观察患者的身体变化，避免在手术中出现异常情况[10]。
1.3 观察项目
整个研究过程，首先对患者的并发症情况进行观察，包括口腔粘膜炎、胃肠道反应、肛周感染、发热、出血、其他并发症等，统计相应的人数。其次，要对患者的依从性进行评定。第三，统计患者的护理满意度，包括满意、一般、不满意3个标准。满意：患者对护理满意，家属持肯定态度，护理工作展开顺利。一般：患者对护理持一般态度，家属没有与护理人员出现冲突。不满意：患者对护理持否定意见，家属与护理人员出现矛盾，需进行调解。
1.4 统计方法
采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行分析处理；计数资料行χ2检验；计量资料用（x±s）表示；相关数据进行t检验；差异有统计学意义（P
2 结果
2.1 两组患者并发症对比
经过统计，两组患者在术后均出现了一定的并发症，但由于观察组患者在术前采取了综合性的护理措施，因此观察组患者的并发症情况，低于对照组。观察组患者胃肠道反应患者为2例（4.0%），口腔粘膜炎患者为6例（12.0%），肛周感染患者为2例（4.0%），发热患者为3例（6.0%），出血患者为4例（8.0%），其他并发症患者为6例（12.0%），并发症概率为46.0%；对照组患者胃肠道反应患者为4例（8.0%），口腔粘膜炎患者为9例（18.0%），肛周感染患者为4例（8.0%），发热患者为5例（10.0%），出血患者为6例（12.0%），其他并发症患者为9例（18.0%），并发症概率为74.0%，对比两组患者差异有统计学意义（P
2.2 依从性
为了能够更好的对比术前护理效果，该研究对两组患者的依从性进行分析。通过大量的数据搜集，发现观察组患者的依从性明显优于对照组，证明综合护理优于常规护理，能够较大程度的提升患者的依从性，对患者的积极意义较大。经过统计，观察组患者的疾病认知为（28.1±0.3）分，遵医行为（26.2±0.6）分，服药治疗为（28.3±0.6）分，饮食情况为（25.4±1.6）分，情绪反应为（13.2±4.1）分；对照组患者的疾病认知为（20.3±1.2）分，遵医行为（17.4±0.3）分，服药治疗为（18.6±1.5）分，饮食情况为（15.6±0.3）分，情绪反应为（26.4±2.2）分，对比两组患者差异有统计学意义（P
2.3 护理满意度
由于术前护理对造血干细胞移植患者的影响较大，因此，该研究对两组患者的护理满意度进行统计。经过数据的搜集，发现观察组患者的护理满意度明显高于对照组。观察组患者满意24例（48.0%），一般23例（46.0%），不满意3例（6.0%），满意度为94.0%；对照组患者满意11例（22.0%），一般10例（20.0%），不满意29例（58.0%），满意度42.0%，对比两组患者差异有统计学意义（P
3 讨论
3.1 造血干细胞移植患者术前护理分析
随着医疗水平的提升，造血干细胞移植的成功率也在上升。作为治疗恶性血液疾病的有效方法，造血干细胞移植的每一项工作都必须做到位，尤其是术前护理工作。从客观的角度来分析，术前护理工作将直接影响患者的手术效果和日后的康复程度。从该研究结果来看，两组患者均在术前进行护理，虽然得到的效果存在差异，但都在不同程度上对患者的治疗及康复产生了较大的积极影响。相对而言，观察组患者采用的综合性护理，明显优于对照组的常规护理。为此，在今后的造血干细胞移植术前护理中，应积极应用综合性护理。除此之外，还应该将术前护理中的细节工作做好，例如，在饮食护理方面，必须保证患者的正常营养摄入，将高蛋白、高热量、高维生素的食品提供给病人，并积极鼓励其增加进食。
3.2 关于造血干细胞移植病人术前护理的讨论
在现阶段的研究中，造血干细胞移植成为了业界内的重要课题，相对的，术前护理工作也引起了业界和社会上的广泛重视。本次研究中，在并发症方面，观察组患者胃肠道反应患者为2例（4.0%），口腔粘膜炎患者为6例（12.0%），肛周感染患者为2例（4.0%），发热患者为3例（6.0%），出血患者为4例（8.0%），其他并发症患者为6例（12.0%），并发症概率为46.0%；对照组患者胃肠道反应患者为4例（8.0%），口腔粘膜炎患者为9例（18.0%），肛周感染患者为4例（8.0%），发热患者为5例（10.0%），出血患者为6例（12.0%），其他并发症患者为9例（18.0%），并发症概率为74.0%，两组患者比较差异有统计学意义（P
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造血干细胞篇5
【关键词】 造血干细胞移植
Origin of Mesenchymal Stem Cells in Bone Marrow of Patients after Allogeneic Stem Cell Transplantation
Abstract
The aim of this study was to investigate the origin of bone marrow-derived mesenchymal cells in 34 patients who had received a sex-mismatched hematopoietic stem cells transplant (HSCT).The mesenchymal stem cells (MSC) from 34 patients were collected for test.The different passage MSC of patients were analyzed by flow cytometry (FCM) to reveal the cell surface antigen expression.The polymerase chain reaction (PCR) analysis of the amelogenin (AMEL) genes was used to detect donor cells from host cells.The cultured MSC were stained by fluorescence in situ hybridization (FISH) probes for chromosomes X (Xp11.1-Xq11.1) and Y (Yq12) to distinguish donor cells from host cells.The results indicated that 31out of 34 cases showed the confluent stroma and 24 out of these 31 cases were successfully passaged for more than 5 generations which could be used for PCR and FISH analysis.According to FCM results the number of CD14+CD45+ cells，which was regarded as monocyte/macrophage from the cultured MSC (passage 5) was less than 0.04%.In PCR assay，the marrow-derived MSC from the passage 5 were found to be of host origin. FISH assay demonstrated that marrow-derived MSC from the passage 5 were found to be of host origin up to 100%.It is concluded that the origin of MSC in bone marrow of patients after allogeneic stem cell transplantation was confirmed to be derived still from the recipients their own.
Key words
hemotopoietic stem cell transplantation; allogeneic hemotopoietic stem cell transplantation; mesenchymal stem cells
源于人骨髓的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC），占骨髓中有核细胞的0.01%-0.001%。从骨髓中分离出的MSC能在体外大量扩增且具有自我更新的能力［1］。MSC能产生多种细胞因子、化学因子及细胞外基质蛋白，在造血细胞的生长、成熟、归巢及增殖中均具有重要的作用［2-5］。在异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)临床植活的患者中MSC是否为供者植活一直存有争议［6-11］，目前对SCT后患者MSC的来源问题尚无定论。本研究选择临床上供受者性别不同的allo-HSCT后临床造血植活的34例患者作为研究对象，对allo-HSCT
后造血植活患者中骨髓源的MSC的植活来源，进行了研究。
材料和方法
病例
病例来自北京大学人民医院或北京道培医院，为供受者性别不同、造血植活的allo-HSCT患者共34例，其中男性17例，女性17例，年龄介于16至48岁之间。预处理包括马利兰（busulfan，Bu）/环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）或Bu/CTX加抗胸腺细胞球蛋白（antithymocyte globulin，ATG）。造血干细胞来源为：骨髓移植者3例，动员的外周血干细胞移植者2例，骨髓加动员的外周血干细胞移植者19例，骨髓加动员的外周血干细胞再加第三者脐血混合移植者10例。移植后给予的免疫抑制剂：氨甲喋呤（methotrexate，MTX），霉酚酸酯（mycofenolate mofitile，MMF）及强的松等。利用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、人类白细胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)分型及短串联重复序列聚合酶链反应（short tandem repeat-polymerase chain reaction，STR-PCR）等方法进行造血植活及嵌合分析（附表）。Table.Characteristics of 34 patients received HSCT（略）
MSC的分离及纯化
对患者及供者行髂后上棘穿刺抽取骨髓血10 ml，骨髓用PBS (0.01 mol/L，pH 7.4)1∶1稀释后，Percoll（比重1.073 g/ml）900×g梯度离心30分钟，离心后收获分离的单个核细胞，用DMEM-LG洗2次，以1.4×105 /cm2的细胞密度接种于T-25培养瓶中，培养基DMEM-LG（Gibco BRL life Technologies，USA）含10% FBS，在37℃，5% CO 2条件下孵育。每3天全量换液，待细胞长至85%至90%融合时，用0.25%胰蛋白酶-1 mmol/L EDTA (Gibco BRL life Technologies，USA) 37℃条件下消化3-5分钟，以1.3×104/cm2的密度在T-75瓶中进行传代培养。每次传代均更换新培养瓶。
流式细胞术(flow cytometry，FCM)分析
不同代数MSC用0.25%胰蛋白酶-1 mmol/L EDTA消化，配制成1×106/ml的细胞浓度，与CD14-PE，CD45Per-CP，CD44-FITC，CD29-APC(BD Biosciences，USA)避光孵育15分钟，用PBS（ 含2%血清白蛋白）洗涤2次后，以PBS悬浮或1%多聚甲醛固定待上机。对照采用IgG1-PE，CD45-Per-CP，IgG2b-FITC，IgG-APC。每次上机( FACS BD Biosciences，USA)分析10 000个细胞，使用CellQuest 软件 (BD Biosciences，USA)进行数据分析。
釉基质基因分析
通过单步PCR反应扩增釉基质基因（amelogenin，AMEL）可同时分辨男性或女性细胞来源［12］，电泳后女性细胞形成单条977 bp的条带(AMGX)，而男性细胞形成2条977 bp (AMGX)及788 bp (AMGY)的条带，第5代患者MSC悬浮于PBS中，使用DNA提取试剂盒(Omega Bio-tek，Inc.)进行DNA抽提。每个DNA样本进行PCR扩增，使用的探针为：探针A: 5′-CTGATGGTTGGCCTCAAGCCTGTG-3′，探针B: 5′-TAAAGAGATTCATTAACTTGACTG-3′ ；探针C: 5′-GCCCAAAGTTAGTAAT-TTTAC-3′ 。PCR的最终反应体系30
μl，包括：250 ng DNA，每种探针30 pmol，250 mmol/L dNTPs，2.5 U Taq DNA 聚合酶 (Sangon，Shanghai.China)，2.5 μl 10×PCR 缓冲液（50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl，pH 9.0，0.1% Triton X-100，1.5 mmol/L MgCl2），首先进行95℃预变性3 分钟，PCR反应包括94℃ 1分钟，60℃ 2分钟，72℃ 2分钟，共30个循环。PCR扩增产物采用含0.5 μg/ml溴化乙锭的1.5% 琼脂糖凝胶电泳显影。
荧光原位杂交分析
使用CEPX spectrumOrangeTM/Y spectrumGreenTM DNA探针试剂盒(Vysis inc.USA)进行FISH分析，以分辨男性或女性细胞。第5代患者MSC用甲醇：冰醋酸固定滴片，用70%甲酰胺2×SSC进行标本DNA变性，73℃，5分钟，室温下不同浓度乙醇脱水，加10 μl探针后，42℃过夜，次日0.4×SSC及2×SSC/0.1% NP-40洗脱，10 μl DAPIⅡ复染核，使用荧光显微镜（Olympus BX-61，Japan）进行观察，每个样本计数500个细胞。ProbeChekTM 玻片(Vysis inc，USA)作为阳性对照。
结 果
MSC的生长及传代能力
34例患者MSC培养后31例(91.1%)均达到了融合；1例(2.9%)达到部分融合，2例(5.9%)未达融合，后3例患者均为临床上造血恢复极差的患者；24例患者MSC能成功传代5代以上，且可进行PCR、FISH分析。
患者MSC的富集及鉴定
在MSC的培养过程中，通过全量换液去除淋巴细胞，而如何去除骨髓基质中的混有的单核-巨噬细胞是非常重要的，因为巨噬细胞也是黏附细胞并能成为基质层的一部分［13］。本研究利用 0.25% 胰酶-1 mmol/L EDTA反复消化细胞以最大限度去除巨噬细胞，因为巨噬细胞对0.25% 胰酶-1 mmol/L EDTA不敏感，每次传代我们都更换培养瓶以进一步去除瓶壁上对此酶不敏感而未消化下来的巨噬细胞。FCM检测结果显示，患者各代CD44+CD29+CD45-CD14-细胞比例不同，0、2、3、4、5、6、9和16代CD44+CD29+CD45-CD14-细胞依次为32.47%±1.54，90.34%±2.11、95.23%±2.34、95.13%±0.93、96.68%±1.53、95.12%±3.28、92.19%±3.12和80.56%±4.23。CD44为黏附分子，CD29属整合蛋白家族，CD14、CD45为造血细胞表面分子，CD14为巨噬细胞相对特异性表面抗原，这说明所培养的细胞绝大多数为易贴壁的MSC，混有的巨噬细胞不多，我们选择第5代MSC用于PCR及FISH分析，其中CD44+CD29+细胞占（98.41±0.91）%，CD14+CD45+细胞占（0.039±0.02）% (图1)，这表明用于PCR及FISH分析的第5代MSC中，混有的单核-巨噬细胞数极低［（0.039±0.02）%］，低于PCR及FISH检查的敏感度（3%及1%）［10］。
患者MSC的植活嵌合分析
对第5代MSC细胞我们进行了位于性染色体上的AMEL基因检查。AMEL是釉质母细胞分泌的一种基质蛋白，AMEL基因位于人类X和Y性染色体上，编码一种高度保守蛋白，女性（XX）有2个相同的AMEL等位基因，而男性（XY）有2个不同的AMEL等位基因［12，14-16］。电泳结果显示，女性为1个977 bp的单条带，而男性则为788 bp和977 bp处两个不同的条带。本研究PCR结果显示：临床上造血植活的患者，其骨髓第5代MSC来源于患者本人(图2)。
对第5代MSC细胞利用双色荧光DNA探针进行了FISH 检查，CEP X DNA探针 (位于DXZ1区) 是位于X 染色体上(Xp11.1-Xq11.1)AT集中区的一个α微卫星DNA序列，荧光标记为橘黄色，CEP Y DNA 探针(位于DYZ1区) 是位于Y 染色体上Yq12区域的一个特异性的微卫星DNA序列，荧光标记为绿色。在荧光显微镜下观察：女性细胞的细胞核中显示2个相同的橘色荧光标记，而男性细胞的细胞核中显示1个橘色荧光标记，1个绿色荧光标记。本研究的FISH结果显示，临床上造血植活的患者，其骨髓培养扩增第5代MSC100%来源于患者本人(图3)。
讨论
Allo-HSCT越来越广泛地用于造血系统及非造血系统疾病的治疗中，而骨髓中的造血微环境与细胞外基质构成了骨髓的空间结构，其功能是否正常对于allo-HSCT之后的造血重建起着至关重要的作用［17-19］。allo-HSCT后造血植活的患者，其基质细胞的来源存在争议。Keating等［6］报告了14例患者，发现随着移植后时间的推移，患者的基质细胞逐渐转为供者源的；Simmons等［7］报告同胞HLA配型相合的10例患者，证明患者的基质细胞均为患者源的；Tanaka等［8］报告11例患者，其中7例患者的基质细胞均为患者来源，而4例患者的基质细胞显示了以患者为主的混和嵌合体； Koc等［9］证实移植后的患者 MSC源于患者；Cilloni等［10］报告11例去T细胞异基因HSCT患者，证明患者的基质细胞存在混和嵌合体； Awaya等［11］报告了4例患者，证明患者的基质细胞均为患者源的。
转贴于
因此目前对allo-HSCT后患者MSC的来源问题没有定论，虽然大多数结论倾向于allo-HSCT后患者的MSC源于宿主本身，但纵观起来，这些研究还存在一些问题，比如对所研究的MSC没有进行有目的的纯化及鉴定，以去除可能混杂的巨噬细胞的影响［6-9］。尽管有些研究考虑到了巨噬细胞的影响，但其研究结果并不一致［10，11］。故关于这方面的研究有必要进一步进行下去，以明确allo-HSCT后患者MSC的来源，利于指导临床上的allo-HSCT的相关治疗，为是否在allo-HSCT过程中联合输注MSC提供理论依据。
本研究共分析了34例allo-HSCT患者，其中24例患者进行了PCR及FISH分析，结果证实其MSC均为患者源的。我们选择AMEL基因作为性别鉴定的方法之一，与单纯扩增Y染色体上的基因鉴别性别相比，其优势在于：检测方法同样简便、灵敏、准确，甚至可检测出仅1个细胞或部分降解的DNA 样本［20］，具有临床实用价值。X 特异性片段同时可做为内对照，防止由于Y 扩增产物的缺失而做出错误的结论。选择AMEL基因作为性别鉴定的方法，不论男或女，受检样本DNA如何，均可得出扩增产物，检测结果不受Y 染色体正常变异的影响，若检测不到扩增产物即意味着扩增失败。这一方法可防止由于试验操作过程任一环节失误或Taq 酶缺乏等因素而造成的假阴性结果。我们选择双色间期FISH 分析MSC分裂间期细胞，与单色FISH比较，也避免了假阴性结果的出现，同时结果非常客观且直观。
关于供者MSC没有植入的原因考虑有以下几个方面：首先，预处理方案没有完全清除患者的骨髓MSC以便供者的MSC植入。其次，供者的骨髓移植物中MSC含量太低（2-5 MSC/ 1×106单个核细胞）也使供者的MSC不易植入［21］。第三，不同的输注途径和方法可能会影响MSC的植入； Richard等［22］在对1例重叠综合症的病人进行骨髓移植后，同时将从供者髂嵴获得的骨碎片进行腹腔内注射和直接注入受者的髂嵴，13 天后再静脉输入体外培养扩增的来自供者骨碎片的成骨样细胞，结果发现病人移植后1年骨髓黏附细胞66%、外周血细胞89%为供者来源，2年的时候，呈现95% 的嵌合，并且自身免疫病有显著改善。这一研究在证明基质前体细胞可以植入的同时，也提示不同的输注途径和方法可能会影响MSC 的植入。第四，患者原发性的基质缺陷也有助于供者基质植入，在Horwitz等［23］的一项研究中提示，如果正常的供者基质细胞和异常的宿主基质细胞相比处于竞争优势，它们就能够植入。在此项研究中，33名成骨缺陷的病人在接受常规骨髓移植后，有2人检测到供者来源的成骨细胞。基于以上的分析，补充输入供者MSC应有利于供者MSC在患者骨髓中植入。
总之，本研究结果显示：allo-HSCT后临床上造血植活患者的MSC均源于患者本身，而患者的MSC逆转为供者来源是否对患者有益，补充输入供者MSC是否确实能使供者MSC在患者中植入尚需进一步的研究。
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造血干细胞篇6
【关键词】 单倍体；造血干细胞移植；供者；父亲
DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2017.12.044
目前， 对于恶性血液系统疾病来说， 造血干细胞移植成为一种有效的治疗手段。由于我国独生子女政策的实施， 部分患者不能获得人类白细胞抗原（human leukocyte antigen， HLA）全相合同胞作为供者[1-3]。近年来， 亲缘间单倍体造血干细胞移植术的成功建立， 使得HLA不全相合的亲属例如患者的父母、子女、兄弟姐妹均可以成为供者， 从而解决了供者来源困难的局面。本文分析25例在郑州大学第一附属医院造血干细胞移植中心实施父供子单倍体相合造血干细胞移植治疗血液系统疾病的疗效， 总结报告如下。
1 资料与方法
1. 1 一般资料 选取2008年8月～2013年6月期间， 25例接受父供子单倍体造血干细胞移植患者。受者年龄4～36岁， 中位年龄21岁。其中急性髓系白血病（AML）13例， 其中CR2期2例， CR3期1例；急性淋巴细胞白血病（ALL）11例， BCR/ABL基因阳性2例， T淋巴母细胞淋巴瘤性白血病1例。供者年龄28～55岁， 中位年龄40岁。HLA高分辨配型：8个点相合3例， 6个点相合3例， 5个点相合19例。
1. 2 移植方法
1. 2. 1 预处理方案 患者均采用“改良Bu/Cy+ATG”方案[4]， 阿糖胞苷针4 g/（m2・d）， （-9～-10 d）；白消安片4 mg/（kg・d）， （-6～-8 d）；环磷酰胺针1.8 g/（m2・d）， （-4～-5 d）；兔抗人胸腺T细胞免疫球蛋白2.5 mg/（kg・d）， （-2～-5 d）；卡莫司汀250 mg/（m2・d）， （-3 d）。
1. 2. 2 供者干细胞的动员、采集 供者应用重组人粒细胞集落刺激因子150 μg/次， q 12 h， 连续5 d， 血细胞分离机采集外周血造血干细胞。
1. 2. 3 移植物抗宿主病（graft-versus-host disease ， GVHD）的预防[2] 联合采用环孢素A 3 mg/（kg・d）+吗替麦考酚酯15 mg/（kg・d）+短程甲氨蝶呤（15 mg/m2+1 d， 10 mg/m2+3 d、+6 d）。必要时联合甲基泼尼强龙1～4 mg/（kg・d）、他克莫司等药物。
1. 2. 4 其他 应用脂质体前列腺素E1（20 μg/d）联合还原型谷胱甘肽门冬氨酸鸟氨酸预防肝窦阻塞综合征。自移植前14 d开始口服复方磺胺甲f唑、盐酸小檗碱片、伊曲康唑胶囊进行肠道消毒。
1. 2. 5 植活指标 以持续3 d中性粒细胞≥0.5×109/L， 3 d内不输注血小板， 血小板≥20×109/L， 血型转变、费城染色体的消失、性染色体的转化、微卫星标记转为供者， 作为移植成活标准。
1. 3 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件处理数据。生存分析采用Kaplan-Meier生存分析法。
2 结果
2. 1 移植物中细胞成分及植入情况 分析流式细胞仪结果显示， 父供子组患者植入的单个核细胞、CD34+细胞中位数分别为5.3（3.0～11.4）×108/kg、6.4（1.8～12.8）×106/kg。25例患者均@得完全植入。患者中性粒细胞≥0.5×109/L植入的中位时间为15 d（12～17 d）， 植入血小板≥20×109/L的中位时间为17 d（9～40 d）。
3. 2 移植后GVHD的发生情况 25例中有10例患者发生急性GVHD， 发生率40.0%， 其中2例患者Ⅲ度肠道、肝脏急性GVHD。移植后持续随访100 d， 慢性GVHD的患者7例， 发生率28.0%， 其中广泛型3例。
3. 3 移植后原发病复况 患者随访至2014年6月， 父亲供儿子移植组中原发病复发2例（8.0%）， 1例为急性淋巴细胞白血病患者， 1例为急性髓系白血病复发患者， 后给予输注供者干细胞、化疗持续缓解18个月。
3. 4 移植后患者的生存情况 截止至2014年6月， 随访患者中位时间为15个月， 父亲供儿子移植组中16例无病存活， 9例死亡， 5例死于重度感染， 2例为复发后死亡， 2例死于肠道、肝脏移植物抗宿主病， 移植相关死亡率28.0%。患者2年总生存率为68.0%， 2年无病生存率为68.0%。
3 讨论
造血干细胞篇7
【摘要】 目的: 研究人核迁移蛋C（hNUDC）促进人脐血来源的CD34+细胞增殖、 分化为巨核细胞的作用。方法: 使用Dynal CD34体外分离系统收集人脐血CD34+细胞， 无血清甲基纤维素半固体法体外培养CD34+细胞12 d后， 显微镜下观察hNUDC对CD34+细胞分化增殖为小、 中、 大巨核细胞集落的形态、 数目的影响; 无血清液体培养体系培养CD34+细胞10 d后， 流式细胞术检测hNUDC对CD34+细胞分化增殖为CD41+细胞的表达率及其DNA倍性的影响。结果: hNUDC能够明显促进CD34+细胞分化增殖形成中小型CFUMK集落， 可显著增加巨核细胞表面标志物CD41+的表达， CD41+细胞中DNA倍性显著地高于血小板生成素。结论: hNUDC对促进造血干细胞增殖和分化为巨核细胞具有重要作用。
【关键词】 人核迁移蛋白; 巨核细胞; DNA倍性
［Abstract］ AIM: To study the effect of human nuclear distribution C （hNUDC） on human megakaryocyte proliferation and differentiation from cord blood CD34+ cells in vitro. METHODS: Human CD34+ cells were isolated using the Dynal CD34 Progenitor Cell Selection System from umbilical cord blood. The CD34+ cells were then cultured in serum free methylcellulose semisolid media， the morphologic aspects and number of small， medium and large CFUMK colonies were observed and scored on the day12 by microscopy analysis. The CD34+ cells were cultured in serum free liquid media， cells were removed on day 10 and formation of CD41+ in human megakaryocyte and its DNA polyploidization of nuclear were analyzed on a FACsort flowcytometer. RESULTS: hNUDC supported the formation of small and medium CFUMK colony in serum free semisolid media. Furthermore， hNUDC induced a remarkable increase in expression of the megakaryocyte cell surface marker CD41+ and stimulated the CD41+ DNA polyploidization more effectively than TPO. CONCLUSION: hNUDC may play an important role in megakaryocyte proliferation and differentiation.
［Keywords］hNUDC; Megacaryocyte; DNA polyploidization
［摘 要］ 目的: 研究人核迁移蛋C（hNUDC）促进人脐血来源的CD34+细胞增殖、 分化为巨核细胞的作用。方法: 使用Dynal CD34体外分离系统收集人脐血CD34+细胞， 无血清甲基纤维素半固体法体外培养CD34+细胞12 d后， 显微镜下观察hNUDC对CD34+细胞分化增殖为小、 中、 大巨核细胞集落的形态、 数目的影响; 无血清液体培养体系培养CD34+细胞10 d后， 流式细胞术检测hNUDC对CD34+细胞分化增殖为CD41+细胞的表达率及其DNA倍性的影响。结果: hNUDC能够明显促进CD34+细胞分化增殖形成中小型CFUMK集落， 可显著增加巨核细胞表面标志物CD41+的表达， CD41+细胞中DNA倍性显著地高于血小板生成素。结论: hNUDC对促进造血干细胞增殖和分化为巨核细胞具有重要作用。
［关键词］人核迁移蛋白; 巨核细胞; DNA倍性
血小板生成素（thrombopoietin， TPO）在体外具有调节巨核细胞增殖、 成熟和血小板形成的功能［1］。但研究发现TPO基因敲除小鼠的血小板计数虽然比正常小鼠降低了85%， 但这些小鼠并没有发生出血现象， 仍具有形态正常的巨核细胞和血小板［2］。因此推测， 很可能存在有其他因子， 与TPO一起参与巨核细胞和血小板生成的调控过程。核迁移蛋白C (nuclear distribution C， NUDC)在核迁移中起着关键的作用， NUDC与其家族成员相互作用［3］， 和微管一起参与细胞增殖［4］、 正常的造血、 神经迁移和脑发育。在增生的细胞中可以观察到NUDC强烈的免疫标记， NUDC的水平在红系祖细胞中最高， 在正常人骨髓中， 早期骨髓祖细胞和红系祖细胞中， 人核迁移蛋白C （hNUDC）和mRNA有高水平表达。我们使用重组hNUDC 蛋白， 成功制备了 hNUDC单克隆抗体（mAb）， 前期实验结果表明， hNUDC 蛋白呈点状分布于人巨核细胞、 巨核系白血病细胞株Meg01、 Dami的细胞膜与细胞核中， 而且hNUDC可以特异地与血小板生成素受体（Myeloproliferative leukemia， Mpl）特异地结合， 对于小鼠的巨核细胞系和血小板的生成， 具有与TPO类似的生物活性［5］; 表明hNUDC很有可能是巨核细胞增殖分化调控中一个重要的因子。为进一步确证并检测hNUDC蛋白是否具有参与巨核细胞和血小板生成调控的生物活性， 我们选择正常人脐带血的造血干细胞， 在体外实验观察hNUDC对造血干细胞增殖、 分化的作用， 为脐血巨核系定向扩增的基础研究和临床应用摸索条件， 提供新的研究思路。
1 材料和方法
1.1 材料 Dynal CD34 祖细胞分选系统购自 Dynal Biotech公司; 造血干细胞无血清培养液StemSpan H2000购自Stem Cell Technologies公司; 淋巴细胞分离液购自Amersham Biosciences公司; IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)培养基粉末购自Gibco公司。青霉素和链霉素、 rhTPO、 甲基纤维素均购于Sigma公司。FITC标记的抗人CD41抗体、 抗人IgG抗体购于Biolegend公司。
1.2 方法
1.2.1 免疫磁珠分离法体外分离人脐血CD34+ 细胞 每份脐血均取自广东省造血干细胞库， 样品经产妇正式同意后来自足月分娩的胎儿。 脐血平均采集量为50～80 mL， 用分离缓冲液将肝素抗凝的脐血1∶4稀释， 淋巴细胞分离液 FicollHypaque (JPrep) 水平离心机密度梯度离心， 收集界面层单个核细胞， 用相同体积的分离缓冲液悬浮混匀细胞， 500 g离心20 min; 用分离缓冲液重悬沉淀细胞， 300 g离心20 min; 取沉淀， 将细胞用冰预冷的分离缓冲液重新悬浮至4×1010～4×1011/L， 总体积至少到1 mL。按照Dynal CD34祖细胞分选系统操作说明进行脐血CD34+细胞分选， 得到纯化的CD34+细胞， 细胞计数后用流式细胞仪定量分析分离前后样品中CD34+细胞表达率， 计算纯度和回收率。
1.2.2 hNUDC蛋白的表达、 纯化以及实验分组设计 hNUDC蛋白的表达、 纯化的具体方法参考文献［5］。实验设正常对照组、 TPO 阳性对照组（终浓度为50 μg/L）和 hNUDC 蛋白不同浓度组（终浓度为 50、 100、 500 μg/L）。正常对照组为 pET28大肠杆菌表达系统空载体， 经过与表达 hNUDC 和组氨酸亲和柱纯化hNUDC相同的处理过程， 最后溶解于含1 g/L BSA 的 PBS 缓冲溶液中。
1.2.3 hNUDC对CFUMK集落形成的影响 使用9 g/L甲基纤维素无血清半固体培养， 每毫升培养体系为含5×103个CD34+细胞、 常规剂量链/青霉素以及各种浓度的rhTPO 或hNUDC蛋白， 接种在35 mm 培养皿， 每组重复3个培养皿， 每个培养皿1.5 mL。置37℃、 50 mL/L CO2饱和湿度的孵育箱中培养12 d后计算CFUMK集落数， 根据每个CFUMK集落中包括的巨核细胞数目， 将CFUMK集落分为3类。(1)CFUMK小集落（small CFUMK colony）: 包括3～20个巨核细胞; (2)CFUMK中集落（medium CFUMK colony）: 包括21～49个巨核细胞; (3)CFUMK大集落（large CFUMK colony）: 包括≥50个巨核细胞。倒置显微镜下分别计算大、 中、 小集落数。本实验重复3次。
1.2.4 hNUDC对CD41+细胞阳性表达率的影响 5 mL的无血清培养液体系中含1×104人脐带血CD34+细胞， 无血清培养基StemSpan H2000， 不同浓度的hNUDC蛋白、 TPO和相同体积的对照液体PBS。 37℃、 50 mL/L CO2条件下培养， 每3～4 d半量换液1 次。培养10 d后收集细胞， 用PBS缓冲液洗3次后， 加入FITC标记的抗人CD41抗体， 同时用FITC标记的抗人IgG抗体作为阴性对照， 4℃孵育30 min， 用PBS缓冲液洗3次后， 用-20℃预冷的乙醇固定细胞， 采用双色FACSVantage流式细胞仪定量分析CD41+细胞阳性表达率。
1.2.5 hNUDC对CD41+细胞的DNA含量和倍性的影响 细胞收集与标记方法同上， 用-20℃ 预冷的乙醇固定细胞并透膜后， PI (propidium iodide)染色， 采用双色FACSVantage流式细胞仪定量分析CD41+细胞的DNA含量和倍性。
1.2.6 动态观察脐血CD34+细胞液体培养体系中 CD41+细胞形态和数目 倒置显微镜下， 在培养第7、 10天动态观察hNUDC与TPO对CD34+造血干细胞形态学的影响。培养第10天收集培养的细胞进行吉姆萨染色观察。
1.2.7 统计学分析 实验数据以x±s表示， 所有数据均采用SPSS/PC11.5软件分析， 统计方法为单因素方差分析LSD法， 其中CD41+细胞的表达率及其DNA含量的比较先行平方根反正弦变换（Y=arcsinx ）变换， 以P
2 结果
2.1 体外分离脐血单个核细胞和CD34+细胞 每次采集的抗凝处理后脐血在40～ 60 mL之间， 经淋巴细胞分离液离心分离单个核细胞。去黏附细胞后得(0.98±0.33)×108的单个核细胞 ［(0. 7～1. 3)×108 ］， CD34 +细胞比例为(1.20±0.33)% ［(0. 8～1. 7)%］。流式细胞术测定分离前后样品中CD34+百分含量分别为3.2%和95.3%。本次实验中应用的免疫磁珠分离系统一次吸附过滤的CD34+干细胞的平均纯度达到88%。从1×108个界面细胞， 平均可以分离获得1×106 CD34+干细胞。
2.2 hNUDC对CD34+细胞增殖分化为CFUMK集落的作用 对照组只有小型CFUMK集落生长， hNUDC在50 μg/L时即能促进CFUMK小集落生长， 与对照组比较差异有统计学意义(P
2.3 hNUDC对CD34+细胞分化为CD41+细胞的作用 人脐带血CD34+细胞与不同剂量组的hNUDC液体培养10 d后， 对照组CD41+细胞百分含量仅为5.43%; 50 μg/L和100 μg/L剂量的hNUDC组的CD41+细胞百分含量分别34.03%和43.56%， 明显高于对照组 (P
2.4 hNUDC对CD41+细胞DNA倍性的作用 单独经过50 μg/L和 100 μg/L hNUDC培养后细胞的DNA含量明显高于对照组 (P
2.5 hNUDC培养不同时间对CD41+细胞形态的作用 使用hNUDC蛋白单独培养人脐带血CD34+细胞后的第7天， 可以观察到许多“巨大细胞”形态的巨核细胞， 在第10天达到最多， 大部分细胞成为成熟巨核细胞， 部分细胞还伴随有前血小板的形成。100 μg/L hNUDC剂量组的效果最好， 500 μg/L hNUDC剂量组的“巨大细胞”数量低于50 μg/L和100 μg/L hNUDC剂量组。TPO单独使用后， 在第5天就可以观察到许多“巨大细胞”形态的巨核细胞， 并随着培养时间延长增多变大。在第10天， 收集各组细胞进行吉姆萨染色 (图1)， 可见单独经过100 μg/L hNUDC培养后， 倍性为四倍体、 八倍体的巨核细胞所占比例较多， 并且部分细胞已经进入前血小板状态。TPO组中的大部分细胞的细胞核为二倍体和四倍体， 进入前血小板状态的细胞很少见到。对照组中的细胞几乎全部为不成熟的原始干细胞， 表现为淋巴母细胞样的祖细胞形态， 细胞核多为深染的单核细胞， 部分为二倍体细胞， 但体积很小。图1 hNUDC对人CD34+细胞培养10 d后形态学的影响
3 讨论
血小板的形成极其复杂， 是多水平调控的生物学过程。包括多潜能造血干细胞向巨核细胞分化、 增殖。在巨核细胞趋于成熟时细胞核经数次分裂成为多倍体， 但胞体不分裂， 在产生血小板之前细胞呈不规则形状， 细胞伸出细长的微管， 微管的顶端连着突起的胞质， 胞质膨大后脱落即成血小板。这一过程又称前血小板(proplatelet)生成过程［6］。然而前血小板生成以及血小板释放的过程目前仅仅是假设， 几十年来一直是人们关注的课题。TPO是血小板形成中一个最重要的细胞因子［1］， 但是研究表明TPO并不是必不可少［2］， TPO受体mRNA表达量的增加并不受TPO的影响［7］。另有实验证明， TPO只作用于巨核细胞的增殖及早期成熟时期， 对巨核细胞后期成熟尤其对前血小板的生成没有明显的促进作用［8］。本实验以TPO作为阳性对照， 其结果与以往研究的报导结果一致。
为研究hNUDC促进人脐血来源的CD34+细胞增殖、 分化为巨核细胞的作用， 本实验在无血清甲基纤维素培养系统中加入不同浓度的hNUDC蛋白， 结果显示在hNUDC存在条件下， 生长的CFUMK集落主要为包括3～50个巨核细胞的CFUMK 中小集落。而TPO 在 50 μg/L时对大、 中、 小型CFUMK都有明显的促进生长作用， 主要产生的集落为包括≥50个巨核细胞的CFUMK大集落。一般认为， CFUMK大集落生长来源于较原始的巨核祖细胞， 而中小型的CFUMK集落生长来源于较成熟的巨核祖细胞。我们发现不同剂量组的hNUDC均能促进CFUMK小集落形成， 因此说明hNUDC能够在体外直接作用于较成熟的巨核祖细胞， 促进巨核祖细胞细胞分化增殖形成集落， 对巨核细胞具有促进增殖和分化的作用。
在无血清液体培养系统中添加hNUDC蛋白， 纯化后的CD34+细胞向着巨核系细胞分化， 并表达巨核系细胞特异的表面标志物CD41。随着CD34+ CD41+巨核系定向祖细胞向成熟的巨核系细胞分化， CD41 抗原表达明显增加， 并且细胞的DNA含量高于对照组。值得注意的是CD41+细胞的DNA倍性分布中， 二倍体、 四倍体和八倍体的比例与TPO组相近， 但16倍体和32倍体的分布则明显高于TPO组。吉姆萨染色进一步确证了hNUDC培养后的人脐带血分化后细胞形态学变化， 巨核细胞倍性增加， 细胞质更加成熟， 其效果明显优于TPO。
本实验结果提示， hNUDC对巨核细胞活性的作用可能主要集中于巨核细胞的后期成熟阶段， 尤其是巨核细胞的多倍体化与胞质成熟阶段或者血小板生成的阶段。 hNUDC很可能是促进造血干细胞向巨核系分化及诱导成熟的晚期作用的重要因子。但是对于其重要作用机制以及与其他调控因子的相互作用还需要进一步深入研究。
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造血干细胞篇8
【关键词】 造血干细胞 CD117+细胞 免疫磁珠分离法 小鼠 近交BALBC
造血干细胞（HSCs）研究面临的首要问题是获得大量纯化的造血干细胞，并去除杂质细胞对实验的干扰[1，2]，近年在纯化技术方面的研究不多，尤其是对小鼠的研究较少。CKit或干细胞因子受体SCFR（CD117）是小鼠HSCs的主要标志[3]，2006年采用免疫磁珠分离法(MACS)分选骨髓造血干细胞亚群CD117，并用流式细胞仪进行计数，希望为造血干细胞的纯化和大量制备提供实验方法和理论支持。
1 材料和方法
1.1 实验动物
BALB/C小鼠，(20±1)g，雌雄随机，10只/组，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。
1.2 试剂和仪器
BSA购自杭州四季青生物工程材料研究所，荧光标记小鼠抗体CD117PE磁珠试剂盒、抗生物素磁珠、MiniMACS分离器及MS分离柱，均购自Miltenyi Biotec公司，流式细胞仪(FACS Calibur)购自BD公司。
1.3 实验方法
1.3.1 小鼠骨髓细胞收集
颈椎脱臼处死小鼠，取小鼠股骨、胫骨，放在盛有缓冲液（含2 mmol/L EDTA，0.5%BSA的PBS）的平皿中，去除骨上的肌肉组织及骨膜，切除骨的两末端，用1 ml注射器（带4号针头）插入股骨膝盖端、胫骨骨端，用缓冲液反复冲洗骨腔，直至骨发白，所得细胞过200目滤网，1 500 r/min离心10 min，小心去除上清液，加入5 ml缓冲液混匀，进行细胞计数。
1.3.2 MACs分离CD117细胞
1.3.2.1 小鼠系别细胞去除 用缓冲液按40 μl/107个细胞重悬小鼠骨髓细胞。加入生物素化抗体混合物10 μl/107个细胞，混匀，4～8 ℃孵育10 min。加入缓冲液30 μl/107个细胞，20 μl抗生物素微珠，混匀，4～8 ℃孵育15 min。加入5 ml缓冲液洗涤细胞，1 500 r/min离心10 min，完全去除上清液。
1.3.2.2 磁性标记和分选CD117细胞 将分选后得到的细胞用缓冲液按80 μl/107个细胞重悬。加入CD117微珠20 μl/107个细胞，混匀，4～8 ℃孵育15 min，缓冲液1 ml/107个细胞洗涤细胞，1 500 r/min离心10 min，完全去除上清，用500 μl缓冲液重悬，所得细胞悬液加入MS分选柱中，收集先行流出的未标记细胞组分，并用1 500 μl缓冲液冲洗MS柱，此为CD117阴性细胞。将分选柱移出磁场，1 ml缓冲液快速将分选柱上滞留的细胞洗脱下来，这些细胞是磁性标记的CD117阳性细胞。
1.3.3 流式细胞仪分析
将分选前的标本、对照管、分选后阴性管标本及分选后阳性管标本进行流式细胞仪分析。在上述富集细胞管中加入100 μl缓冲液，10 μl CD117抗体混匀，4 ℃黑暗中孵育10 min，加入1 000 μl缓冲液1 500 r/min离心10 min，完全去除上清液，加入500 μl缓冲液混匀，送流式细胞分析，设阴性对照和空白对照。
1.3.4 细胞染色计数
0.4% 台盼蓝按9∶1（V∶V，细胞悬液量：染色液量）对细胞进行染色。镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。细胞活力的测定: 0.4% 台盼蓝染色1 min，计算活细胞率，活细胞率（%）=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%。
1.4 统计学处理
用SPSS 11.1进行统计学数据分析，用配对样品t检验，P
2 结果
2.1 骨髓细胞的收集
从1只小鼠股骨、胫骨可收集5.25×107个骨髓细胞，细胞活力90%，2只小鼠股骨、胫骨可收集8.48×107个骨髓细胞，细胞活力92%。
2.2 MACS分选造血干细胞
1只小鼠股骨、胫骨可收集（1.1±0.3）×105个造血干细胞。
2.3 流式细胞仪分析结果
免疫磁珠纯化前CD117阳性细胞纯度为（41.56±18.77)% ，纯化后CD117阳性细胞纯度为(88.68±4.74)%，纯化前后有明显差异（P
3 讨论
骨髓内主要有两类干细胞群体，即造血干细胞(hematopoietic stem cells， HSCs)和间充质干细胞(MSCs)。HSCs是卵黄囊、胎肝和骨髓中比例极小的细胞群， 成年小鼠HSCs占整个骨髓细胞的0.01%～0.05% [4]，具有自我更新的能力， 能维持宿主终生造血功能和分化，生成血液中的各种成熟细胞[5]，获取高度均一的HSCs是开展细胞生物学特性等各项研究的基础。
CD117干细胞因子受体是具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体，广泛分布于HSCs群中，60%～75%的CD34+造血干细胞同时表达CD117，其配体——干细胞因子(SCF，)在HSCs的生存和增埴、分化中起着重要作用。研究发现CD34+CD117+比CD34+CD117-细胞具有更高的集落形成能力，而 CD117可高频率表达于多能干细胞表面，对HSCs的分化具有重要作用，是小鼠HSCs的重要标志[6]。CD117也存在于肥大细胞和急性髓样白血病细胞表面[7]。
细胞分离或纯化的目的是收获高纯度保持原有活性的单一细胞群，并最大限度地减少靶细胞的丢失。免疫磁珠是一种包被有单克隆抗体的磁性微粒， 它可特异性地与靶物质(细胞、蛋白质、DNA 和细菌等) 结合， 使之具有磁顺应性， 继而在外加磁场的作用下被滞留， 从而与其他成分分离， 达到富集纯化的目的[8，9]。MACS 根据最终选留物质的不同可分为阳性选择(留取与磁珠结合的阳性物质) 和阴性选择(留取不与磁珠结合的阴性物质)。本实验采用免疫磁珠(MACS) 阳性选择法分选HSCs，从1只小鼠股骨、胫骨可收集（1.1±0.3）×105个HSCs，先进行系别细胞去除的阴性分选，去除成熟造血细胞（T细胞、B细胞、单核细胞或巨噬细胞、粒细胞、红系细胞及其定向前体细胞），细胞与一系列生物素化的抗系别抗原抗体和抗生物素磁珠共同孵育，磁性标记后去除系别细胞，这种标记过程保留了系别标志阴性的细胞，可根据CD117的表达对这些细胞做进一步的磁珠阳性分选。磁珠体积极小，不会对细胞造成机械性压力，孵育时间短，操作过程快，磁性抗体和磁性标记物间的反应可在几分钟内完成，从复杂的细胞混合物中分离出很高纯度的细胞。
根据HSCs表达或不表达某些细胞表面分子，采用相应的荧光素标记抗体进行免疫染色，根据阳性、阴性选择原理，应用流式细胞仪分选获得具有某些细胞表面特征的细胞。本实验采用流式细胞仪分析计数，免疫磁珠纯化前小鼠骨髓CD117阳性细胞为(41.56±18.77)%，经免疫磁珠纯化后CD117阳性细胞百分比为(88.68±4.74)%，表明MACS是一种安全、有效并实用的分选HSCs CD117的方法，省时、简便、纯度高。
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