液相色谱范文

液相色谱篇1

关键词：葛粉;葛根素;HPLC

Abstract:Object:DeterminationofPuerariainPuerariaPowderMethods:PuerariaweredeterminedbyHPLC.ThemobilephasewasMeOH－H2O－HAc（30：70：0.5）.Detectionwavelengthwasat250nm.Results:Puerariashowedagoodlinearrelationship.Theaveragerecoverywas98.6%andRSDwas1.76%.Conclusion:Thismethodwassimple,quickandaccurate.

Keywords:PuerariaPowder;Pueraria;HPLC

葛根为豆科植物野葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi的干燥根,是常用中药材,具有解肌退热，生津，透疹，升阳止泻功效，用于外感发热头痛、项背强痛，口渴，消渴，麻疹不透，热痢，泄泻，高血压颈项强痛等[1]。现代研究证实，葛根中的主要有效成分为葛根素等异黄酮类化合物，具有抗炎解热、扩张冠状动脉血管、增加冠状动脉血流量的作用，同时也有降低血压的作用。有关葛根中葛根素等异黄酮的含量测定研究已有不少报道[2-5]，但对葛粉中葛根素含量测定报道不多。本文对葛粉中葛根素的提取条件和测试条件等进行比较研究,并采用高效液相色谱法对葛粉样品进行了定量分析,结果令人满意。

1实验部分

1.1仪器与试剂

岛津LC－10Atvp高效液相色谱仪；SPD－10Avp紫外检测器；岛津UV－265紫外分光光度仪，多功能榨汁机/搅拌机SG300－I（上海科骏电器有限公司）。甲醇（色谱纯），水（二次蒸馏），其余均为分析纯。葛根素对照品（中国药品生物制品检定所）；鲜葛（浙江省永嘉县潘坑乡）。

1.2色谱条件

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱C18diamonsil5ul(150×4.6mmI.D)，MeOH－H2O－HAc（30：70：0.5）为流动相，紫外检测波长250nm。

2结果与讨论

2.1提取溶剂浓度的选择

精密称取同一样品约0.1g,分别加30%乙醇、50%乙醇和80%乙醇10ml，超声提取60分钟，进样5ul,比较峰面积，实验结果表明30%乙醇提取最好。

2.2超声提取时间的选择

精密称取同一样品约0.1g,分别加30%乙醇10ml，超声提取30分钟、45分钟、60分钟，进样5ul,比较峰面积，实验结果表明超声60分钟为最佳提取条件。

2.3流动相及流速的选择

试验时曾采用下述流动相进行测定：甲醇－水（25：75）、甲醇－水－醋酸（30：70：0.5）、甲醇－水（30：70）为流动相，结果采用甲醇－水－冰醋酸（30：70：0.5）为流动相，样品分离好。而流速也以1.0ml/min为合适。

2.4标样溶液的制备

称取一定量葛根素对照品,用30%乙醇溶解配制成浓度为13ug/ml的葛根素标准液。

2.5葛粉制备

取鲜葛用水洗净切片,称取20g放入搅拌机内，搅拌三次，每次1分钟，每次加水200ml，150ml，100ml，合并浆汁放置二天，去掉上面的水，下面的粉浆用定量滤纸过滤，低温干燥，放入干燥器中备用。

2.6供试品溶液制备

精确称取一定量葛粉于10mL容量瓶中,加30%乙醇10ml,超声提取1h,滤纸过滤,滤液过0.45um滤膜作为供试品溶液。

2.7线性关系考察

在上述色谱条件下，分别进标样溶液0.5、3、5、7、10μl，测得各峰面积。以葛根素为横座标（A），以峰面积（Y）为纵座标，计算得回归方程：Y=3.90×106x+728.14,相关系数r＝0.9999；结果紫外检测葛根素在0.0065-0.13μg范围内呈良好线性关系。

2.8精密度试验

取上述标样溶液，连续进样5次，测定，RSD为1.11%。

2.9重复性试验

取同一样品重复测定5次，RSD为1.61%。

2.10稳定性试验

取上述供试品溶液，0、2、5、7、10h进样，RSD为2.1%，10小时内进样稳定。

2.11回收率试验

取已知含量的样品，分别加入葛根素标样，按上述方法测定5次，平均回收率为98.6%,RSD为1.76%。见表1。

2.12样品分析

精密吸取标样溶液5μl与供试品溶液5μl，注入液相色谱仪，测定，结果:葛粉中葛根素的含量为0.06%（n=3），见下图。

3讨论

本文采用高效液相色谱法测定葛粉中葛根素的含量,方法简单、快速、准确，结果满意，可用于葛粉中葛根素的含量测定。

[参考文献]

[1]中国药典2005版一部.2005:233-234.

[2]章育中，杨凡。高效液相色谱法测定葛根及其片剂中异黄酮的含量.药物分析杂志，1984,4(2):67.

[3]张蕾,潘扬，朱蓉贞，等。不同品种及产地的葛根中葛根素含量的比较。中国中药杂志，1995,20(7):399.

[4]肖学凤,高岚。HPLC法测定不同产地葛根中葛根素的含量。中草药，2001,32(3):220.

液相色谱篇2

【摘要】  

目的建立鲜壁虎的高效液相色谱指纹图谱，探讨不同壁虎间的相似程度。方法采用高效液相色谱法分析鲜壁虎提取液中相关物质的保留时间和吸收强度，对6种壁虎样品共有峰峰面积进行聚类。结果选定的色谱条件给出了较好的保留时间分布和吸收强度，建立起鲜壁虎的hplc指纹图谱，聚类分析给出了相应结果。结论该hplc指纹图谱可用于鉴定鲜壁虎，壁虎所含化学成分的多寡等因素与其品种相关。

【关键词】   鲜无蹼壁虎 指纹图谱 高效液相色谱法 聚类分析

abstract：objectiveto establish an hplc fingerprint of fresh gekko, and to discuss the similarity among gekkos. methodsthe retention time and absorption intensity of extracts of gekko were determined by hplc,peak area of six kinds of gekko samples’mutual peaks were applied to grade by hierarchical cluster analysis. resultsbetter distribution of retention time and absorption intensity were shown under the given chromatographic condition, the hplc fingerprint was established and the result of hierarchical cluster analysis was got. conclusionthe fresh gekko can be identified effectively and the chemical constituents of different gekko are related to the kinds.

key words：fresh gekko;  fingerprint;  hplc;  hierarchical cluster analysis

    壁虎（gekko）属隶爬行纲有磷目蜥蜴亚目。我国现知有壁虎属动物11种［1］。其性味咸、寒，有小毒，能够祛风、定惊、散结、解毒，治中风瘫痪、历节风痛、风痰惊痫、瘰疬、恶疮、破伤风、痈疮、胃嗝气等症。 现代 医学认为壁虎对肿瘤、结核等疾病有确切疗效［2～5］。近年来对壁虎抗肿瘤作用的基础研究也有所报道［6，7］。笔者应用“壁虎散” 治疗 肺癌等肿瘤疗效显著，且副作用很小，是潜在的可开发利用的抗肿瘤中药品种。由于壁虎种类较多，它们体内所含的有效药物成分的种类及含量的多寡均会有所不同。为保证研究中所用壁虎的种属纯正，建立壁虎的高效液相色谱指纹图谱，用于对壁虎的鉴定具有重要的意义。

1  仪器与材料

1.1  仪器与试剂黄金系列通用ⅰ型高效液相色谱仪（126型泵，166型紫外-可见光检测器，gold软件；美国bechman公司）；ds-1高速组织捣碎机（上海标本模型厂）。色谱纯乙腈（美国tedia公司），分析纯95%乙醇。

1.2  药材实验所用壁虎的物种及来源见表1。壁虎均于9月从产地购买，并经当地药检所鉴定。表1  6种壁虎的种类及来源（略）

2   方法和结果

2.1  色谱条件层析柱：购自大连江申分离 科学 技术公司（瑞士 spherigel c18填料）， 4.6 mm×250 mm，5 μm粒度。流动相：a，亚沸水；b，乙腈。梯度洗脱：0～5 min，100% a，流速0.7ml/min ；5～ 6 min流速由0.7 ml/min升至1 ml/min；6～16 min，0～10% b；16～21 min，10～40% b；21～31 min，40 ～ 60% b；31～46 min，60～100% b；46～60 min，100% b。进样量10 μl；检测波长205 nm；室温。

2.2  供试品的制备购买秋季捕捉的活壁虎，随机选取14～15只（约50 g），在容器内放置72 h，以消化、排空壁虎体内的食物，蒸馏水清洗晾干后准确称重，置入95％酒精致死，用捣碎机粉碎匀浆（转速：10 000/ min），50 ml 95％酒精分两次涮洗捣碎机，合并涮洗液以浸泡匀浆后的壁虎，不时摇动，浸泡24 h后抽滤；滤渣用50 ml 95％酒精再次浸泡提取，抽滤；合并两次的提取液，定容于100 ml；置-2℃冰箱内保存；使用时，取一定量的样品液经0.45 μm微孔滤膜过滤；当其温度转变为室温后，以10 μl进样分析。

    潍坊干壁虎的处理：将捕捉到的潍坊活壁虎按常规方法制成干品；取15只干壁虎，用100ml 95％酒精浸泡1 d（软化），用捣碎机粉碎匀浆（转速：10000 r·min-1），用原酒精液继续浸泡2 d，提取，抽滤；滤液经0.45μm微孔滤膜过滤，以10μl进样分析。

2.3  方法学考察

2.3.1  检测波长的确定由于业界对壁虎所含的有效药物成分尚无系统的研究和分析，其有效药物成分组成和结构尚不得而知，为了使壁虎乙醇提取液中所含有的物质能在紫外光检测波长下被最大限度地检出，宜选择短波长进行检测。在选用205，210，215，220 nm进行色谱分析后，对比所得色谱图发现：除色谱吸收的强度随波长增大而依次降低外，吸收峰的数量多寡无明显改变，据此而确定205 nm为色谱参数，用于色谱检测。

2.3.2  流动相及柱温的确定实验表明使用空调控制室温，在22～26℃的温度条件下，色谱峰的保留时间没有明显的变化，经5次在该温度范围内的测试，结果显示色谱峰的保留时间、峰高、峰面积数据的rsd均小于1.2%，在室温条件下的测试结果是可靠的。经采用不同的流动相梯度洗脱，方法中所述的梯度是最佳方案，尤其是方法开始的最初5 min以0.7 ml/min的流速进行洗脱可使保留时间较短（3～8 min）的物质得到较好的分离，满足测试的需要。

2.3.3  稳定性考察取鲜无蹼壁虎的乙醇溶液测试品分别在0，6，12，24，36，48 h不同时间进行测试，考察色谱峰保留时间与吸收强度的一致性，如图1中所标示的各指纹峰的保留时间与吸收强度的rsd均小于1.1%。

2.3.4  仪器精密度实验在空调的设定温度为24℃时，取测试品连续五次进样，图1中各指纹峰的保留时间、峰高及峰面积的rsd均小于0.6%。

2.3.5  重复性实验取壁虎分4次制作供试品，分别进样。结果显示各指纹峰的保留时间、峰高及峰面积的rsd均小于1.6%。

2.4  色谱图中选作指纹峰的保留时间区间范围的确定

2.4.1  壁虎95％酒精提取液的后续处理采用潍坊壁虎作抗肿瘤药用效果研究，匀浆后的壁虎用95％酒精连续浸泡提取5次，抽滤后，合并5次提取的抽滤液，在30℃下减压蒸馏浓缩，除去其中的乙醇，获得带黄色固体沉淀以及脂肪物的水液；添加一倍体积的蒸馏水后，水液经正己烷和二氯甲烷分别各萃取4次，得黄色水溶液。水溶液在30℃下减压蒸馏浓缩，冻干，得棕色浸膏状物。浸膏状物用95％酒精溶解，作硅胶柱层析，得各层析后样品。

2.4.2  各水溶性样品的抗肿瘤效果用各样品以mtt法对hepg2和ct-26肿瘤细胞作体外抑瘤率实验。其中棕色浸膏状物浓度为5 mg/ml时，抑瘤率最高可达37%，硅胶柱层析得到的4#样品，浓度为1 mg/ml时，抑瘤率最高可达49%，棕色浸膏状物对小鼠作体内抑瘤实验，通过肿瘤实体称重对比，抑瘤率可达63%。体内、外抑瘤实验均表明壁虎含活性较高的抗肿瘤有效药物成分。

2.4.3  确定指纹峰的保留时间区间范围通过上述各水溶性样品进行相同色谱条件下的色谱分析，发现各色谱图中的吸收峰的保留时间均在20 min以内，考虑到抗肿瘤有效成分是水溶性的（谢爽、王学美的研究也有同样的结论［6，7］），故将保留时间在20 min以内作为选取指纹峰的时间界限。

2.5  聚类分析为进行各种壁虎所含抗肿瘤成分的比较，对各壁虎色谱数据进行了聚类分析。聚类分析使用各壁虎保留时间在20 min以内共有的12个吸收峰，以每个壁虎的12个吸收峰的总面积除各吸收峰的峰面积，得到如表2所示的各吸收峰的相对峰面积，以此进行聚类分析。聚类分析使用spss统计软件，采用离差平方和法（ward’s method）及欧氏距离（euclidean distance）。表2  各壁虎共有吸收峰的相对峰面积（略）

2.6  结果

测试所得各壁虎的hplc色谱图，其中潍坊壁虎的色谱图如图1所示。

    实验发现潍坊壁虎干品的色谱图（图2）与鲜品的有很大的差异，故鲜品的指纹图谱不适用于干品。

    以各鲜壁虎色谱图中保留时间作标记的各吸收峰为指纹峰。取其中吸收强度最大的（保留时间分别为5.234，5.263，5.273，5.246，5.259，5.250）吸收峰为 参考 峰，确定其它指纹峰的相对保留时间和相对峰高，以归一化法（rai=ai/σai）确定各指纹峰的相对峰面积。由色谱中各指纹峰的相对保留时间、相对峰高及相对峰面积（ra），即可构建起样品的hplc指纹图谱。各鲜壁虎色谱图中吸收峰的保留时间见表3。表3  各壁虎hplc指纹峰的保留时间（略）

    聚类分析所得的树状关系图见图3。

3  讨论

    壁虎和乙醇的选择:为尽可能全面地研究分析壁虎体内所含物质的抗肿瘤活性，需要尽可能多地将壁虎所含物质提取出来。选用乙醇是考虑到乙醇与水的互溶性，选择鲜壁虎是因为鲜壁虎自身含水。在第一遍用乙醇浸泡壁虎匀浆物时，壁虎体内所含的水溶性好的物质可借助于壁虎体液与乙醇的互溶而被提取出来，当抽滤分离后，滤渣中含水甚少，再次用乙醇浸泡滤渣时，可保证其中脂溶性良好的物质也被提取出来。若对壁虎干品进行同样的处理，则干壁虎所含有的水溶性物质就不可能被很好地提取出来。从干、鲜壁虎的色谱图中可以看到，在梯度洗脱的前半段时间，干壁虎的吸收峰数少、吸收强度低，而在后半段时间内，干、鲜壁虎的吸收峰数基本相等，但干壁虎的吸收强度要显著大于鲜壁虎的。

    关于壁虎的hplc色谱图：鲜壁虎的乙醇提取液中所含物质种类繁多，在某一特定色谱条件下，不可能使所有的吸收峰都得到良好的分离，尽管在样品洗脱的初始阶段（前20min）吸收峰的分离状况不甚理想，峰的重叠相对较为严重；但色谱数据的稳定性良好，可以满足作为指纹图谱的需要。

    关于相似度分析：仅从各壁虎在20 min以内的吸收峰的保留时间就可发现，在各吸收峰的保留时间序列中，各种壁虎均有峰的缺失。按时间序列，吸收峰的总数有20个，但六种壁虎的共有峰只有12个；因此从图谱的直观上就可以区分出不同的壁虎。为不同壁虎的鉴定提供了依据。

    聚类分析的结果表明6种壁虎中，g.sw和g.a最为相似，相似度可达98.61%，当聚为五类时，两者为一类，其他壁虎各自为一类；当聚为四类时，g.sw和g.a为一类，g.h和g.j为第二类，g.su 和g.t各自为一类；当聚为两类时，g.sw、g.a、g.t和g.su为一类，而g.h和g.j为另一类。尽管在目前这12个共有峰尚未归属为某个确定的化合物，但随着研究的深入，各吸收峰的化合物名称及分子结构将一一确定；聚类分析将提供壁虎间相互替代的思路。

    尚需解决的问题：拟通过后续的进一步分离纯化，以获得抗肿瘤活性成分的纯品及其抗肿瘤效果，并解决指纹图谱中各吸收峰的归属问题。

    本文所介绍的壁虎hplc指纹图谱可用于壁虎的鉴定，聚类分析的结果给出了不同壁虎间的相似程度。

【参考 文献 】

 

液相色谱篇3

【关键词】液相色谱法；葡萄酒；日落黄；胭脂红

doi：10.3969j.issn.1004-7484（x.2013.10.758文章编号：1004-7484（2013-10-6195-01

日落黄与胭脂红是人工合成的可食用色素，常被添加至各类饮品中以提高其色泽的鲜艳度与观赏性。由于人工合成色素多用煤焦油作为原料制备而成，且制备工艺与水平参差不齐，导致其安全性普遍较差[1]。人工合成色素中的苯环、蒽环等对于人体具有毒害作用，长期使用会严重影响消费者的健康，因此我国对于人工合成色素的用量有严格的限制。葡萄酒中日落黄与胭脂红的使用较为常见，对于含乙醇的饮品中日落黄与胭脂红的含量测定主要采用液相色谱法[2]。本文通过液相色谱法对葡萄酒中的这两种色素进行测定，具备准确、高效、灵敏、简便等优点，最终取得了满意的结果。

1资料与方法

1.1仪器与试剂本文所用高效液相色谱仪为岛津公司生产的LC-20AT系列高效液相色谱仪，BT224s电子天平（德国赛多利斯公司，NeXpower1000超纯水仪（韩国公司，日落黄（中科院：GBW（E100003a，胭脂红（中科院：GBW（E100004a，甲醇（中国天津市康科德公司为色谱纯，乙酸铵（中国天津市科密欧公司为分析纯，水为超纯水。

1.2色谱条件与标液的配制本文色谱柱为岛津公司生产的C18柱（5um，150×4.6mm，流动相为甲醇-乙酸铵（0.02molL，流速为1.0mlmin，柱温为32℃，检测波长为509nm，洗脱方式如下：

标准溶液的配制方法为：准确称取日落黄与胭脂红各0.1000g，采用超纯水溶解，定容至100ml，获得1.0mgml的标准溶液。工作溶液为取上述标液进行稀释，获得1ugml、5ugml、10ugml、20ugml以及50ugml的工作液。

1.3样品的前处理与测定准确称取样品5.00g，置于50ml烧杯中加热以除去乙醇，将其转移至25ml容量瓶中定容，过0.45um水系滤膜后，常规注入进样瓶中准备进样。根据保留时间定性，峰面积定量，定量方法采用外标法。

2结果

2.1线性与检出限通过对混标工作液进行测试可得，在1.00-50.0uml范围内，日落黄与胭脂红的线性关系良好，日落黄回归方程为y=59.032x-8.6513，线性相关系数为0.9999，胭脂红的回归方程为y=44.733x-6.452，线性相关系数为0.9999。以信噪比为SN=3计算检出限可得，日落黄的检出限为0.20mgkg，胭脂红的检出限为0.25mgkg。

2.2精密度与回收率取6份葡萄酒样品，加入st1进行上机检测可得，6次进样结果的精密度分别为日落黄2.2%，胭脂红1.5%，符合相关要求。选取高（st5、中（st3、低（st1三种浓度进行加样回收可得，回收率为92.0%-98.8%，见表2。

3讨论

3.1前处理方法的选择本文选用水作为提取溶剂，其原因在于日落黄与胭脂红均为水溶性色素，因此采用水提取即可获得较高回收率。有研究显示采取聚酰胺吸附法进行提取能够获得更好的回收率，且基质干扰较小[3]，但本文认为葡萄酒中所含基质较少，对于色谱柱的影响较小，因此采用一步提取法即可达到满意的结果。

3.2色谱条件的优化本文检测的两种色素：日落黄与胭脂红均属于水溶性色素，具有较强的极性，因此在选择色谱柱时采用反相色谱柱，以达到较好的分离效果[4]。在选择流动相时，本文最初选择了3对流动相：甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙酸铵，通过平行操作后，最终获得甲醇-乙酸铵作为流动相的分离效果最佳。检测波长最初设定为483nm，因为日落黄在481、483、486nm处均有最大吸收，但由于胭脂红在509nm处的吸收较大，因此选择509nm能够完全满足日落黄与胭脂红均具有较大吸收。

3.3光谱优化本文所采用的紫外检测器理论上可以采集波长为190-700nm的光谱图，对于色谱峰的定性具有可靠性，且能够有效避免单纯凭借保留时间对待测物质进行定性的不准确性。本文选择509nm的目的在于避开254nm以下波长，降低杂质的干扰，使得待测物质在低浓度的情况下仍能够获得良好匹配度。

4小结

本文认为该方法采用一步提取法对样品进行前处理，能够达到操作简便、处理快速的优点。利用梯度洗脱的方式能够使得检测方法灵敏度更高，受杂质干扰更小。采用本法对葡萄酒中的色素进行分析，能够使色谱峰良好分离，结果准确性高、可靠性佳、分析速度快。因此对于葡萄酒中的色素分析可以采用该方法，对于其他液体食品中人工合成色素的测定，该方法也具有一定的指导意义

参考文献

[1]谷岩，曲明.高效液相色谱法测定饮料的食用色素[J].化学分析量，2004，13（1：42-43.

[2]欧阳燕玲，谢唯平，陈春祝.高效液相色谱法检测葡萄酒中5种人工合成色素的方法探讨[J].中国卫生检验杂志，2005，15（10：1218-1220.

[3]星林，邵仕萍.高效液相色谱检测食品中日落黄色素[J].食品安全质量检测技术试刊论文集，2008：15-19.

液相色谱篇4

关键词：氟乐灵 超高效液相色谱

一、前言

氟乐灵（Trifluralin），别名茄科宁、特富力、氟特，其化学名称为1-二丙基氨基-2-硝基-4-三氟甲烷基-6-硝基-苯，是广泛应用的选择性芽前二硝基苯胺类除草剂，对人畜低毒，对鱼类高毒。氟乐灵作为除草剂大量使用于花生、大豆、棉花和蔬菜等作物地除草，年用量5000吨以上。目前氟乐灵检测以气相色谱方法为主，由于氟乐灵农药的极性和热不稳定性，这些测定方法的灵敏度和重现性均不是十分理想。因此，开展氟乐灵农药含量检测技术的研究具有重要意义。本文研究了超高效液相色谱法测定氟乐灵含量的可行性，建立了一种高效、准确的超高效液相色谱测定方法。

二、实验部分

1.仪器与试剂

液相色谱仪：大连依利特，具紫外可变波长检测器；色谱工作站； C18色谱柱：5 μm，200*4.6mm（i.d）；超微孔滤膜：0.45μm；甲醇（色谱纯）；二次蒸馏水；氟乐灵标样为已知含量≥98％ 。

2.操作条件

检测波长：276 nm；进样量：5 μL；流动相：甲醇：水（80：20）；柱温：室温 ；流速：0.8 mL/min。保留时间：8min

3.测定步骤

3.1标准储备液配制 准确称取氟乐灵对照品10 mg置100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，浓度为100g/mL。贮存于一18℃ 以下冰箱中。使用时根据需要吸取适量标准储备液用甲醇稀释成标准工作液。

3.2标准系列工作溶液配制分别吸取一定量的标准储备液，用甲醇稀释成浓度为0.05～5mL的标准系列工作溶液，临用新配。

3.3试样溶液的配制

称取试样0.5g （精确至0.0001g）置于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，超声波振荡5min。冷至室温后，准确移取5mL置于25mL容量瓶中，以流动相定容，摇匀后经0.45μm 滤膜过滤，滤液待测。

3.4测定

在上述色谱操作条件下，待仪器基线稳定后，连续注入数针标样溶液，计算各针峰面积，直至相邻两针峰面积变化小于1．5％后，按标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。

3.5计算

将测得的两针试样溶液以及试样前后两针标样溶液中氟乐灵的峰面积进行平均，试样中氟乐灵质量百分含量X按下式计算：

X％=

式中：

A1-标样溶液中氟乐灵面积平均值

A2 -试样溶液中氟乐灵面积平均值；

m1 -氟乐灵标样的质量；

m2 -试样的质量；

P -标样中氟乐灵的质量百分含量。

三、结果与讨论

1.检测波长的选择

为了确定最佳检测波长，我们采用紫外分光光度法对最佳检测波长进行了考察。用甲醇稀释氟乐灵标准品溶液至5g/mL，参照紫外可见分光光度法，在200～400 nm的波长范围进行扫描，在276nm的波长处有最大吸收。因此，我们选择276 nm作为检测波长。

2.流动相的选择超高效液相C18色谱柱 200*4.6mm（i.d），可以对氟乐灵进行分离，以甲醇和水（80：20）作为流动相时，氟乐灵峰形较好，没有干扰，保留时间8min，满足检测需要。

3.线性方程和检出限

配制氟乐灵浓度0.05～5g/mL的系列标准溶液，按照2.2建立的仪器条件进行测定。以峰面积y对浓度 （/g/mL）作标准曲线，线性方程为Y=36.57507 X+1.18461，相关系数r为0.999 97，表明氟乐灵在浓度0.05～5g/mL范围内的线性良好。

4.回收率试验

我们进行加标回收率试验，以考察方法的准确度和重现性。每批次同一浓度进行5个平行试验，回收率结果见表1。

表1 氟乐灵的添加回收率

可以看出在0.01～0.5m/kg添加浓度范围内，平均回收率为75.2～90.6％，相对标准偏差为2.7～7.9％ ，适用于氟乐灵的测定。

四、结论

液相色谱篇5

【摘要】  【目的】建立丹参药材中水溶性成分丹酚酸类和脂溶性成分丹参酮类的超高效液相(uplc)指纹图谱方法，为丹参的质量控制提供快速、科学的方法。【方法】以acquity c18 beh(21 mm×100 mm，17 μm)色谱柱，乙腈(a)体积分数04%甲酸溶液(b)梯度洗脱，90%~50%a，0~10 min;75%a，15 min。检测波长280 nm，柱温30℃，流速05 ml/min。【结果】在15min内得到丹参药材水溶性和脂溶性成分的指纹图谱，峰容量85。并采用液质连用技术(hplcdadesi/msn) 鉴定了其中的20个特征峰。【结论】uplc指纹图谱方法具有灵敏、快速、简便、准确等特点，适合于丹参药材及其制剂的指纹图谱研究和质量控制。

【关键词】  丹参/化学;丹酚酸类/分析;丹参酮类/分析;指纹图谱;色谱法，超高效液相;液质连用

丹参是我国应用最广泛的中药品种之一，临床上有很好的疗效，以丹参作为原料药或君药的单一或复方制剂种类繁多。丹参药材指纹图谱的研究主要集中在分别研究丹参的水溶性成分和脂溶性成分指纹图谱[1-6]，这些方法基本均是将水溶性与脂溶性成分分开，分别建立指纹图谱。作为一种药材中的两大类成分，若能将两者结合起来，在同一张谱图上得到表征，直观地比较其化学成分的差异，将是一项十分有益的工作。目前也有一些报道采用高效液相色谱—二极管阵列检测器(hplcdad)或高效液相色谱—质谱检测器(hplcms)连用的方法建立同时表征丹参药材中水溶性与脂溶性成分的指纹图谱，但是采用hplc 技术，尚难以兼顾和保证两类成分都具有良好的分离度，而且耗时较长。因此，本课题组尝试采用快速色谱技术——超高效液相色谱(uplc)建立丹参的指纹图谱，现报道如下。

1材料与试剂

11实验材料共收集了12个省、市(区)的丹参商品药材13份(表1)。药材经上海中医药大学中药研究所吴立宏博士鉴定为唇形科植物salvia miltiorrhiza bge.的干燥根茎。

12仪器与试药waters acquity uplctm超高效液相色谱仪，包括acquity binary solvent module 二元可选四溶剂高压梯度泵，含在线真空脱气机、acquity sampler module 低扩散自动进样器、acquity tuv detector高速紫外检测器及empower ii色谱管理软件(milford，boston，ma，usa)。milliq system超纯水制备器(millipore，bedford，ma，usa)，kq250db数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，bp211d型电子天平(satorius co.ltd.，德国)。甲醇、乙醇、甲酸均为分析纯(上海国药集团试剂有限公司)，乙腈为色谱纯(merck公司)，超纯水为milliq处理水(millipore co.)。对照品丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸b、丹酚酸a、二氢丹参酮i、丹参酮i、隐丹参酮和丹参酮iia均由上海中药标准化研究中心提供。

2方法与结果

21 色谱条件与质谱参数

211超高效液相色谱条件 acquity c18 beh(21 mm×100 mm，17 μm)色谱柱，乙腈(a)-体积分数04%甲酸溶液(b)梯度洗脱，90%~50%a，0～10 min;75%a，15 min。检测波长280 nm，柱温30℃，流速05 ml/min，进样量2 μl，运行时间15 min。表1不同产地丹参药材

212超高效液相色谱—质谱连用(lcms)条件 流动相为乙腈(a)—体积分数04%甲酸溶液(b)，洗脱程序与上述条件相同。柱后分流，分流比为1∶50，进样量10 μl，柱温30℃，电喷雾离子源(esi)，源电压-32 kv，负离子模式，雾化气(gas1)：233 pa，帘气(cur)：16 psi，去簇电势(dp)：-20v，聚焦电势(fp)：-80 v，去簇电势2(dp2)：-20 v。质谱扫描质量范围质荷比(m/z)100～800。

22样品溶液和标准品溶液的制备

221样品溶液的制备取丹参粉末05 g(过40目筛)，精密称定，精密加入体积分数10%甲醇20 ml，浸泡30 min后，超声提取30 min，放冷，3 000 r/min离心10 min，取上清液5 ml置25 ml量瓶中。残渣加甲醇20 ml，浸泡30 min后，超声提取60 min，放冷，3 000 r/min离心10 min，取上清液将上述25 ml量瓶补足至刻度，即得。

222标准品溶液的制备取对照品丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸b、丹酚酸a、二氢丹参酮i、丹参酮i、隐丹参酮、丹参酮iia适量，精密称定，置同一容量瓶中，用甲醇溶解，制成含上述对照品102、126、113、106、137、118、762、100、114、122、119 μg/ml的溶液，作为对照品溶液。

23方法学考察

231精密度实验取同一份供试品溶液，连续进样5次测定，以丹酚酸b为参照峰，分别计算20个特征色谱峰的相对保留时间和相对峰面积sr值，均小于3%。说明仪器精密度良好。

232稳定性实验取同一份供试品溶液，分别于1、3、5、7、9、12、24、48 h进样测定，以丹酚酸b峰为参照峰，分别计算20个特征色谱峰的相对保留时间和相对峰面积sr值，均小于3%，说明样品溶液在48 h内稳定。

233重复性实验同一样品粉末分别精密称取5份，按照上述样品制备方法制成供试品溶液，进样检测。以丹酚酸b峰为参照峰，分别计算色谱中20个特征色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的sr值，均小于3%。说明该方法的重复性良好。

24结果与分析

241丹参高效液相指纹图谱主要色谱峰的lcms鉴定以13个产地丹参药材的共有模式作为丹参药材的指纹图谱(图1)。在该指纹图谱中，20个色谱峰被选为特征峰。通过与对照品比较相对保留时间(tr)，紫外光谱(uv)和液相色谱—质谱联用(lcms)质谱数据(见表2)，结合对照品和文献[7-12]对照，确定了19个色谱峰的归属为1号峰丹参素，2号峰原儿茶醛，3号峰咖啡酸，4号峰丹酚酸d，5号峰丹酚酸g，6号峰丹酚酸e，7号峰丹酚酸c，9号峰迷迭香酸，10号峰紫草酸，11号峰丹酚酸b，12号峰丹酚酸a，13号峰异丹参酮iia，14号峰羟基丹参酮iia，15号峰丹参新醌a，16号峰丹参酮iib，17号峰二氢丹参酮i，18号峰隐丹参酮，19号峰丹参酮i，20号峰丹参酮iia。11号峰(丹酚酸b)既是该指纹图谱中的最强峰，又是有效成分。故以其为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间(tr)和相对峰面积(arp)，结果见表3。表2丹参药材中化学成分质谱数据及鉴定表313批不同产地药材中20个特征峰的相对峰面积值

242丹参药材uplc指纹图谱分析采用上述已建立的指纹图谱方法，对13批丹参药材进行指纹图谱分析，得不同产地丹参药材指纹图谱，结果见图2(彩图页第616页)。为了说明丹参药材之间的差异，引入总差异率ptd(%)的概念。差异率的定义是以每个特征指纹峰与相应的标准特征指纹峰的面积归一化值间的差与标准特征指纹峰面积归一化值的比值来表示两者间的差异程度，总差异率则是将每个特征指纹峰的差异率求和即得。计算公式：

ptd=σnias′-ai′as′×n

其中，ptd 为总差异率，as′为标准特征峰面积归一化值，ai′为待比较药材特征峰的面积归一化值，n为特征峰个数。以ptd代表样品图谱与标准图谱之间的相似度，当ptd>1时，表明待测样品与标准样品之间差异较大，说明待测样品有可能非欲鉴定品种。当ptd<1时，值越小说明待测样品与标准样品越相似。

在本实验中，选取13批丹参药材样品的特征峰面积归一化值的平均值作为标准特征峰面积归一化值(表4)，结果显示：(1)这些丹参药材的化学成分的分布具有相似性，每批药材被检测的色谱峰的数目几乎相等。(2)丹酚酸b的色谱峰占非常高的比例，最高达6313%，最低有3598%，说明该化合物是药材中主要成分之一。(3)水溶性成分中，丹参素的含量均较低，脂溶性成分以5个色谱峰为主(平均占总脂溶性成分的80%以上)。(4)就每一个化学成分来说，药材之间的相互差异比较大，13批药材统计处理，所有成分的sr均在20%以上。(5) 根据ptd值来看，13个产地或收集地的丹参药材ptd值均小于1，说明13个样品与标准样品之间的相似度均较高。表4不同产地13批丹参药材指纹图谱共有峰面积归一化值

3讨论

丹参中的两大类化学成分极性差异较大，文献报道显示采用hplc对这两类成分进行指纹图谱分析，通常耗费时间长而且色谱峰之间并不能达到理想的分离度，较难在一张图谱上直观地比较这两种成分之间的差异[1-6]。本课题在大量实验的基础上优选出合适的uplc色谱条件，建立丹参的指纹图谱，只需运行15min就可以将丹参的水溶性与脂溶性成分在同一张色谱图上表征，且色谱峰之间有较好的分离度，达到了高分离度兼顾快速的目的，适合于大量复杂样品的分析。

中药的指纹图谱研究中，hplc法是最常用的分析技术，但是对于一些复杂体系如中药的指纹图谱研究，hplc相对来说也是一种慢速技术，由于中药中所含化学组分多，化学差异较大，为保证目标组分的分离度，需要较长的运行时间，有时也可得到理想的色谱参数如分离度、对称因子和容量因子等。如何在得到理想的色谱参数的情况下，尽可能地缩短分析时间是科研人员比较关注的问题。uplc的色谱柱采用了17μm的小颗粒填料，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量，能显著提高分离的效率从而达到缩短分析时间的目的。

本实验中采用了uplc技术建立丹参药材的指纹图谱。结果显示，在15min中内即可获得丹参水溶性成分和脂溶性成分的指纹信息。丹参药材的uplc指纹图谱与hplc指纹图谱比较，色谱峰的个数、整体分布和峰形基本一致，但增加了最难分离物质对的分离度，增加了峰容量，减少了分析时间，说明uplc比hplc的分离能力强。

uplc与hplc具有相同的分离原理，因此uplc色谱条件在hplc条件的基础上稍加优化即可得到理想的色谱图结果。本实验根据上述uplc的色谱条件获得了丹参药材及其制剂的指纹图谱，且与hplc色谱指纹图谱一致的结果，因此，采用uplc 指纹图谱方法具有灵敏、快速、简便、准确等特点，适用于丹参药材及其制剂的指纹图谱研究和质量控制，值得推广和应用。

【参考文献】

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液相色谱篇6

【关键词】高效液相色谱法；污泥；硝基苯

硝基苯是重要的基本有机中间体和有机溶剂，有剧毒，具有致突变性，会引起中毒如引发高铁蛋白血红症或致死，环境中的硝基苯主要来自化工厂、染料厂的废水废气，国家环保部已将硝基苯类物质列入水中优先控制污染物名单。研究表明，硝基苯污染水体进入土壤后，将会产生比水体污染更严重的后果。水体中硝基苯随灌溉进入农田，会污染土壤，杀死土壤微生物，导致土壤环境恶化，经植物富集，将严重危害人体健康。目前，测定硝基苯的方法有高效液相色谱法[1-2]、气相色谱法[3]、气相色谱-质谱联用发[4]等。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

安捷伦LC1100高效液相色谱仪，C18（250×4.6mm，5μm）色谱柱。

甲醇（HPLC级），正己烷（农残级），硝基苯（成都艾科达，含量>99.5%）。

1.2 色谱条件

色谱柱：C18（250×4.6mm，5μm）

流动相：甲醇：水=80：20

流速：1.0mL/min

检测波长：223nm

柱温：30℃

1.3 样品预处理

称取污泥样71.6g（含水率30%）加500ml浸取剂（含2滴硫酸、1滴硝酸），翻转震荡24h，将500mL浸提液全部过滤，滤液加50mL正己烷用分液漏斗提取3次，共150mL，收集提取液加适量无水硫酸钠去除水分，40℃氮气吹至10mL左右转移至15mL离心管中继续氮气吹至近干，用甲醇定容至1mL，过0.45μm滤膜。

不加污泥样，其余与样品预处理相同，同时做空白试验。

1.4 标准曲线绘制

精确称取硝基苯28.1mg，于25mL容量瓶中用甲醇溶解并定容到刻度线，作为标准溶液的母液，浓度为1124μg/mL。用移液枪从母液中精确移取30、50、100、200μL到安捷小瓶中，用甲醇定容到1000μL，得到浓度分别为33.72、56.20、112.4、224.8μg/mL的标准溶液系列。用移液枪从112.4μg/mL的标准溶液中精确移取10、50μL到安捷伦小瓶中用甲醇定容到1000μL，得到浓度分别为5.620、1.124μg/mL的标准溶液，与上述标准溶液构成一个标准溶液系列。将标准溶液系列分别取20μL进样。用测得的峰面积为纵坐标（Y）对标准浓度进行回归得线性方程：Y=27.88X-7.3174，相关系数r=0.9998，线性范围1.124～224.8μg/mL。

1.5 精密度

取上述样品在上述色谱条件下试验，连续进样7次，根据每次峰面积计算其RSD%值，结果见表1。

1.6 加标回收率试验

称取污泥样72.4g（含水率30%）加标液（1124μg/mL）50μL，按样品预处理方法，制成理论加标量56.20μg的样品。在上述色谱条件下取20μL进样，检测结果见表2。

2 检出限试验

通过稀释标准溶液，经过实验测试，信噪比为3.4倍时，硝基苯的检出限分别为2.26×10-4mg/L。

3 结论

采用硫酸硝酸法浸出，正己烷提取，C18色谱柱（250×4.6mm，5μm），以甲醇：水=80：20为流动相，流速1.0mL/min，223nm为检测波长，用高效液相色谱法对污泥中硝基苯进行测定，具有简便、快速、准确等优点，可作为污泥、土壤等中硝基苯的测定方法。

【参考文献】

[1]刘敬东，王佳祥.高效液相色谱法测定水中硝基苯含量[J].化学工程师，2006， 20（5）.

[2]刘鹏，张兰英，等.高效液相色谱法测定水中硝基苯和苯胺含量[J].分析化学，2009，37（5）

[3]刘宁.固相萃取-气相色谱法测定水中硝基苯类化合物的含量[J].山东化工，2012，41（5）

液相色谱篇7

关键词：甜味剂 液质联用 食品

当今，随着社会的发展，人们越来越在意一些高脂、高糖、高热量的传统甜味食品对身体造成的影响，特别是患有糖尿病、高血糖、高血压、肥胖症等疾病的特殊人群。食品甜味剂，因其甜度高、热值低，被应用在食品的加工过程中替代蔗糖，很好地解决了这一问题，如糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、安赛蜜都是目前市场上食品行业中最为常用的甜味剂。但这些人工合成的甜味剂或多或少对人体都有一定的影响，在国家食品添加剂标准中都有相应的适用范围和限量要求[1]。

目前，食品中多种甜味剂的检验方法研究较多，主要有液相色谱和液质联用法，其中液质联用的方法多采用串联四级杆液质联用[2-3]，采用单级质谱检测的也仅局限于单一甜味剂的检测[4]。本文主要探讨利用单级液质的方法进行多种甜味剂检测方法的研究，从而避免液相色谱检测时存在误判的可能，也避免串联液质投入费用大，消耗气体量大等缺点。

1、材料与方法

1.1 材料、设备与试剂

1525-ZQ4000型液质联用仪（美国Waters公司）； Milli-Q纯净水系统（美国密理博公司）；甲醇（HPLC级）；乙酸铵（分析纯）；甜蜜素、安赛蜜、糖精钠（美国Sigma-Aldrich公司）；阿斯巴甜（美国Supelco公司）。

1.2 色谱条件

色谱柱为Symmetry Cl8 （150mm×3.9mm i.d.， 5μm）；流动相未甲醇-乙酸胺（0.02mol/L）溶液（体积比为20：80）；流速为1mL/min；色谱的流出组分经一对不锈钢二通阀进行分流.使流出部分进入质谱的流速约为0.3mL/min：进样体积为10μL。

1.3 质谱条件

负离子模式；离子源温度：95℃，脱溶剂温度：400℃，毛细管电压：2.9kV，锥孔电压：30V。脱溶剂氮气流量：400L/小时；锥孔氮气流量：50L/小时；选择特征离子SIR m/z 162 测量安赛蜜，SIR m/z 178测量甜蜜素，SIR m/z 182测量糖精钠，SIR m/z 293测量阿斯巴甜。

1.4 标准溶液配制

精密称取安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜各0.1000g，用流动相溶解后移入100mL容量瓶中，并入流动相稀释至刻度，即含安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜各1mg/mL。分别吸取上述四种甜味剂的储备液于同一容量瓶中，用流动相稀释至刻度。配制成安赛蜜浓度为0.5mg/L，糖精钠和阿斯巴甜浓度为1.0mg/L、甜蜜素浓度为0.2mg/L的混合标准使用溶液。

1.5 样品前处理

液体样品经除气、除醇等处理后，加水定容至适当体积，经0.45μm滤膜过滤。固体样品称重后，加水后超声振荡20min后，定容至适当体积，过滤，弃去初滤液，续滤液用0.45μm滤膜过滤。

2、结果与讨论

2.1定性实验

用扫描模式（Scan）监测，结果见图1。可以看出，各质谱图与相应甜味剂的分子结构相匹配。

2.2流动相的选择

采用不同的流动相配比可以改变四种甜味剂的分离度，当采用Symmetry Cl8 （3.9×150mm， 5μm）填料色谱柱时，当甲醇：乙酸铵=20：80时的分离度较好且分析时间较短。如采用梯度洗脱，理论上能达到更好的分离效果和效率，但在实际检测中因平衡时间较长，检测效率不理想。故推荐采取该配比下等度洗脱方式测定四种甜味剂。所得图谱见图2。

2.3与紫外检测器的对比

在紫外检测器下，糖精钠、安赛蜜都有较高响应值，但阿斯巴甜和甜蜜素响应值较低，特别是甜蜜素，其在紫外区域吸收低。因此目前文献中采用紫外直接检测甜蜜素的灵敏度都较低，仅为50mg/L～100 mg/L 左右，且干扰因素多[5]。本实验采用串联紫外检测器和质谱的方法同时采集信号，对比的色谱及选择离子图见图2，从中可以看出，在紫外色谱图上没有出峰的甜蜜素和出峰很小的阿斯巴甜在选择离子图上都有很好响应。

2.4方法的线性关系和检出限。

分别配制不同浓度甜味剂标准溶液进样、绘制标准曲线；标准品稀释后以3倍信噪比计算最小检出限；称取等量的白酒样品6份，进行加标回收实验并计算其相对标准偏差（RSD），测定结果见表1。

3 、结论

本文采用单级液质联用的方法，一次性将糖精钠、安赛蜜、甜蜜素、阿斯巴甜四种甜味剂分离定性定量，既满足了食品检测的需要，也节约了成本，同时使一些旧仪器的利用率得到提高，可以满足日常检测的需要。

参考文献：

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[4]. 徐春祥 秦金平.液相色谱-质谱联用直接测定白酒中的甜蜜素[J].食品与发酵工业，2006，32（2）：106-107

液相色谱篇8

[关键词] 珍;含量测定;高效液相色谱

[中图分类号]R927.2[文献标识码]B [文章编号]1674-4721(2009)07(a)-134-02

珍由珍珠、牛黄、三七、黄芩提取物、冰片、猪胆汁等组成,具有清热解毒,消肿止痛的功效,主要用于咽喉肿痛,疮疡热疖[1]。为了更好地控制其质量,保证临床用药安全有效,本实验采用了HPLC法测定了制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量[2-5],方法简便、准确、可靠。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-2010高效液相色谱仪,Intersil C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)。

1.2 试药

人参皂苷Rg1对照品(Ⅰ)(供含量测定用,批号:0703-9812)、人参皂苷Rb1对照品(Ⅱ)(供含量测定用,批号:110704-200217)、三七皂苷R1对照品(Ⅲ)(供含量测定用,批号:0745-200006)(中国药品生物制品检定所提供);珍(北京因科瑞斯生物制品研究所提供);乙腈为色谱纯,水为高纯水,其余试剂均为分析纯。

2 定量分析

2.1 色谱条件

Intersil C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相乙腈(A)-水(B)梯度洗脱见表1,检测波长203 nm,流速1.5 ml/min,柱温30 ℃,进样量10 μl,理论板数按Ⅲ峰计算应不低于2 000。在该色谱条件下,样品中被测成分能够达到基线分离,保留时间在15 min内,阴性无干扰,色谱图见图1。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ对照品适量,加甲醇制成每1 ml含Ⅰ0.55 mg、Ⅱ0.45 mg和Ⅲ0.20 mg的混合溶液,即得。

2.3 供试品溶液的制备

取本品细粉适量(约1.5 g),精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50 ml,称定重量,加热回流提取2 h,放冷,用甲醇补足减失的重量,滤过,精密量取续滤液25 ml,蒸干,残渣加1%氢氧化钠50 ml,分次溶解并移入分液漏斗中,用水饱和的正丁醇振摇提取5次(分别为30,30,20,20,20 ml),合并正丁醇液,用正丁醇饱和的水洗涤至中性,每次25 ml,正丁醇液另器贮存,合并水液,用水饱和的正丁醇30 ml振摇提取,醇液与上述正丁醇液合并,蒸干,残渣加乙醚5 ml洗涤,弃去乙醚液,残渣挥尽乙醚,加甲醇溶解,并移至10 ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取续滤液,即得。

2.4 阴性样品溶液的制备

按珍处方,除去三七药材,制备阴性对照样品。按“供试品溶液的制备”项制备阴性样品溶液。

2.5 线性关系考察

分别精密称取Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ对照品适量,加甲醇溶解并稀释,制得浓度分别为1.144 mg/ml、0. 948 mg/ml和0.434 mg/ml的对照品溶液。分别精密吸取该溶液1、2、5、7、10 ml,置于10 ml的容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,各进样10 μl,连续进样2次,按上述色谱条件测定峰面积。以对照品进样量(X)为横坐标,色谱峰峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线,回归方程见表2。

2.6 精密度试验

取同一批供试品溶液,在上述色谱条件下连续进样5次,各样品峰面积的RSD分别为:Ⅰ1.38%,Ⅱ1.11%,Ⅲ1.96%,表明精密度良好。

2.7 稳定性试验

取同一批供试品溶液,在上述色谱条件下,分别于0,2,4,8,12,24 h测定,各样品在24 h内峰面积的RSD分别为:Ⅰ0.69%,Ⅱ1.00%,Ⅲ1.88%,表明样品在24 h内基本稳定。

2.8 重复性试验

取同一批样品,按拟定的方法平行测定6份,平均含量为Ⅰ8.21 mg/g,Ⅱ7.21 mg/g,Ⅲ1.97 mg/g,RSD分别为:Ⅰ0.82%,Ⅱ1.82%,Ⅲ1.91%,表明该方法的重复性较好。

2.9 加样回收率试验

精密称取已知含量的样品6份,各加入一定量的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ,在上述色谱条件下测定,计算回收率,平均回收率分别为Ⅰ96.46%,Ⅱ98.17%,Ⅲ96.27%,RSD分别为:Ⅰ1.01%Ⅱ1.02%,Ⅲ1.06%

2.10 样品测定

取五批样品(批号:20041019、20041122、20050303、20050601、20050605),分别按“供试品溶液的制备”项制备供试品溶液,准确吸取供试液10 μl,在上述色谱条件下测定,总含量(mg/g)分别为5.11、5.14、5.14、5.11、5.16。

3 讨论

3.1 流动相的选择

通过参考有关文献,测定三七中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的流动相多为乙腈-水梯度洗脱。经试验,采用文中流动相,对照品及供试品溶液中各色谱峰均能达到基线分离,效果良好。

3.2 检测波长的选择

取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1对照品,加甲醇分别制成20、30、50 μg/ml的溶液,用紫外可见分光光度仪分别进行200～400 nm波长的扫描,可见人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1均在203 nm处有最大吸收峰,故选择203 nm作为检测波长。

本文提出的 HPLC法能简便、灵敏、准确地测定珍的含量,能满足质量控制需要。

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