基于SRAP和SNP分子标记的国内穿心莲遗传多样性分析

[摘要] 为了阐明国产穿心莲的遗传多样性以及探讨遗传背景对穿心莲药材质量的影响，利用110对SRAP引物和1对SNP特异性引物，对我国7个省份13个样地的103份穿心莲样品进行遗传多样性分析。采用Powermarker V3.25和Mega 6.0软件分析群体的遗传结构，CodonCode Aligner软件分析功能基因单核苷酸多态性变异。聚类分析结果表明各穿心莲样品的遗传距离范围为0.01～0.09，CPS基因片段中未检测到SNP位点，国产各地穿心莲种质间遗传多样性较贫乏，这与穿心莲严格的自花授粉繁殖特性、我国各地引种穿心莲种源来源单一密切相关。遗传背景并非影响各地穿心莲质量差异的主要原因，穿心莲的良种选育以采用突变育种、多倍体育种和分子育种等方法为宜。

[关键词] 穿心莲;SRAP分子标记;SNP分子标记;遗传多样性

穿心莲为常用中药，来源于爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees，以地上部分入药，具有保肝利胆、抗肿瘤、抗氧化、清热解毒、抗菌消炎、消肿止痛等多种作用，临床常用于中止妊娠，治疗疟疾、毒蛇咬伤、糖尿病和高血压等心血管疾病[1]。穿心莲主要含有二萜内酯类化合物，有广谱抗菌和抗病毒作用，有“天然抗生素”之称。据印度1885年的史料记载，穿心莲原产于印度半岛和斯里兰卡[2-5]，在东南亚国家以及我国广为引种栽培[6-7]。由于大量采挖导致野生资源急剧减少，已被列为印度国家保护物种。作为重要的药用资源，自2001年，斯里兰卡规定禁止穿心莲的出口[8]。之后，印度、马来西亚等国家也纷纷对穿心莲种质资源实行了保护[1，9-10]。我国引种栽培穿心莲的确切时间已无法考证，但穿心莲作为中药首见《岭南采药录》（1932年）以“春莲秋柳”之名记载[11]，至少应有80年以上历史。穿心莲目前主产于两广和福建，但北至陕西、长江南北各地多有引种栽培。有研究报道全国不同产地穿心莲的主要活性成分差异较大，药材质量参差不齐[12-14]，这种品质差异可能受到种质遗传背景、产地生态、栽培技术及采收时期等多方面因素的影响，同时也对穿心莲的良种选育提出了需求。

SRAP（sequence-related amplified polymorphism，相关序列扩增多态性）分子标记是分析植物材料遗传背景的有力工具。SNP（single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性）分子标记用于研究基因功能具有重要意义。穿心莲内酯是穿心莲的主要活性成分，在其生物合成中的一个关键步骤是焦磷酸香叶基香叶酯（GGPP）环合形成ent-焦磷酸古巴酯（ent-CPP），从而形成穿心莲内酯的母核结构，而催化这个环合反应的二萜合酶――ent-柯巴基焦磷酸合酶（ent-copalyl diphosphate synthase，CPS），是影响穿心莲内酯生物合成的关键限速酶。有学者利用SSCP技术，在泰国分布的穿心莲中，检测到CPS基因内部存在1个SNP位点[15]。本研究利用SRAP和SNP分子标记研究我国穿心莲不同种群的遗传结构和亲缘关系，以探索各地穿心莲质量差异的遗传背景，探究国内穿心莲种群的进化潜力，为其种质资源保护和良种选育提供科学参考。

1 材料

SRAP分析的103份样品采自7个省份13个采样地（均为栽培地采样），采集单株的新鲜叶片，立即装于自封袋，并加入硅胶干燥剂保存备用。

从13个采样点中，各随机选取2份共计26份用于SNP分析（其中64号样品仅采集1份，故用同时采集的种子育苗取叶，补充1份）。

所有样品经江西中医药大学曹岚副教授鉴定为爵床科植物穿心莲A. paniculata，凭证标本存于江西中医药大学民族传统药现代科技与产业发展协同创新中心标本室（表1）。

表1 材料来源

Table 1 Origin of Andrographis paniculata

No.采集地

1～9广西横县校椅镇校椅村

10～18广西贵港桥圩镇白屋村

19～27广西隆安屏山

28～36四川宜宾南溪裴石乡

37～45四川宜宾南溪江南

46～54安徽潭棚

55～63安徽牛庄

64海南洋浦开发区咸塘社区千年古盐田

65～73福建龙海隆教乡

74～82福建漳浦赤湖镇前张村

83～91广东湛江市遂溪县北坡镇冠粤中草药种植合作社

92～100广东湛江雷州市客路镇林排村

101～103云南景洪南药园（逸野）

2×Taq PCR MasterMix，10×Ex Taq Buffer，TaKaRa Ex Taq，dNTP Mixture，DNA Marker DL2000均购自天根生化科技（北京）有限公司，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。电泳试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司。利用Bio-Rad MJ PTC-200型PCR仪进行扩增，北京六一厂生产的垂直胶电泳系统进行PAGE胶的制备与电泳。

2 方法

2.1 基因组DNA的提取 利用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒（DP305-02）提取基因组DNA。

2.2 SRAP扩增体系和程序 SRAP分子标记扩增所用引物共110对[16]。PCR扩增体系为10 μL，包括2×Taq Master Mix 5 μL，上、下游引物各0.2 μL，DNA模板2 μL，加水补足到10 μL，。PCR扩增程序为：94 ℃ 3 min;94 ℃ 1 min，37 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，循环5次;94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，循环35次;72 ℃ 5 min。

用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物，电泳结束后采用银染法进行染色。染色方法为：去离子水冲洗凝胶2遍，用0.1%硝酸银溶液渗透10～12 min，自来水漂洗2次;用2%的氢氧化钠和1%的甲醛混合液显色，至谱带清晰;将凝胶置于胶片观察灯上进行记录条带。

2.3 SNP分子标记扩增体系和程序 为方便测序需要，在原文献报道基础上，设计1对SNP分子标记扩增引物AP-CPS-F2：CTCAGTTTCCCACCAGCATC和AP-CPS-R2：AGGCACTCTTCAATCTCAGGT。引物扩增产物覆盖了报道中检测到SNP的CPS基因区段，并向该区段上下游各延伸了至少100 bp[14]。PCR扩增体系为50 μL，包括10×Ex Taq Buffer（20 mmol・L-1 Mg2+ Plus）5 μL，TaKaRa Ex Taq（5 U・μL-1）0.25 μL，dNTP Mixture 4 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板8 μL，加水补足到50 μL。PCR扩增程序为94 ℃ 3 min;98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，循环33次;72 ℃ 10 min。

2.4 数据统计分析 以A/A，B/B统计SRAP扩增带型，在相同迁移率位置上有带记为A/A，无带记为B/B。Powermarker V3.25软件采用基于Nei′s（1979）遗传距离的邻接法（Neighor-joining，NJ）进行聚类分析，MEGA 6.0软件进行聚类图绘制。

对于SNP扩增产物选择直接测序，利用CodonCode Aligner软件对测序结果进行分析。

2.5 遗传多样性分析 遗传多样性分析采用国际上通用的多态性信息量（polymorphism information content，PIC）。PIC按照Anderson等[17]的方法计算，对于标记i的PIC计算公式为：

PIC=1-∑1j=1p2ij

其中，Pij表示标记i的第j种带型出现的频率，标记i的总带型从1到n。PIC的大小在0～1，0表示无多态性，1表示具有非常高的多态性。

3 结果与分析

3.1 多态性SRAP引物筛选 在110对SRAP引物组合中有68对表现出多态性，共产生扩增片段763条，其中多态性片段为181条，多态性位点占23.72%。每对引物组合检测等位基因数1～12个，平均为2.70个，多态性比率平均为22.70%。扩增条带数最多的引物组合为me10-em11，多态性比率最高的引物组合为me10-em9。表明这68对SRAP分子标记引物用于穿心莲种质资源的遗传背景分析是有效的（表2）。

表2 103份穿心莲材料的多态性条带统计

Table 2 Number of SRAP polymorphism bands from 103 cultivars

引物组合扩增条带数多态性条带数多态性比率/%引物组合扩增条带数多态性条带数多态性比率/%

me7-em11417.14me8-em316318.75

me6-em91317.69me6-em810220.00

me5-em31317.69me4-em610220.00

me7-em91218.33me3-em410220.00

me9-em41119.09me7-em314321.43

me9-em61119.09me2-em814321.43

me9-em101119.09me8-em19222.22

me7-em61119.09me3-em39222.22

me7-em81119.09me8-em713323.08

me7-em111119.09me8-em813323.08

me4-em41119.09me9-em312325.00

me3-em61119.09me5-em58225.00

me8-em610110.00me10-em715426.67

me2-em510110.00me5-em411327.27

me10-em29111.11me6-em17228.57

me6-em79111.11me1-em410330.00

me6-em109111.11me5-em813430.77

me5-em19111.11me10-em818633.33

me2-em39111.11me8-em109333.33

me1-em89111.11me4-em119333.33

me8-em917211.76me3-em99333.33

me4-em28112.50me9-em117635.29

me3-em18112.50me8-em414535.71

me1-em38112.50me10-em1013538.46

me1-em58112.50me4-em710440.00

me9-em715213.33me4-em105240.00

me9-em915213.33me10-em417847.06

me5-em117114.29me8-em217847.06

me7-em412216.67me8-em1112650.00

me5-em612216.67me6-em28450.00

me5-em1012216.67me8-em513753.85

me2-em26116.67me10-em11211257.14

me2-em612216.67me10-em9121191.67

me1-em1011218.18me8-em316318.75

3.2 不同地理来源穿心莲的遗传多样性水平分析 按照不同地理来源将穿心莲资源分为11组，检测各组的遗传多样性水平。结果表明各地区穿心莲的遗传多样性水平为广西隆安>广西贵港>四川江南>广西横县>四川裴石>广东雷州>安徽牛庄>福建龙海>福建漳浦>安徽潭棚>广东遂溪，主等位基因频率、基因型数、基因多样性、多态性信息量，广西隆安都是最高的（表3）。

3.3 基于Nei′s遗传距离的系统发育分析 利用Powermarker V3.25软件和Mega 6.0软件，对来源于不同地区的103份穿心莲建立了基于Nei′s遗传距离的N-J系统发生树。

根据材料来源所属地理区域进行聚类，结果显示，各地区穿心莲样品的遗传距离为0.01～0.09，均小于0.1，在遗传距离0.01时，13份材料又可分为3类。第1类包括广东雷州和云南景洪，第2类包括四川裴石、四川江南、广西隆安、广西贵港、广西横县、安徽牛庄、安徽潭棚和海南，第3类包括福建龙海、福建漳浦和广东遂溪。以上数据表明遗传距离很小;同一个省份的穿心莲品种并没有完全归到一类，而是和其他省份的聚到一起，栽培种相似性较高，可能品种混杂的情况较严重，并具有相同的起源（图1）。

表3 不同地理来源的穿心莲的遗传多样性分析

Table 3 Genetic diversity of Andrographis paniculata from different geographic areas in China

来源主等位基因频率基因型数样本数等位基因数基因多样性多态性信息量PIC

广西贵港0.868 61.469 691.469 60.173 80.138 4

海南1.000 01.000 011.000 00.000 00.000 0

广西横县0.884 01.447 591.447 50.159 10.127 8

四川宜宾南溪江南0.884 01.508 391.508 30.162 90.133 0

云南景洪0.974 21.077 331.077 30.034 40.026 7

广东湛江雷州0.924 51.281 891.281 80.102 00.081 7

广西隆安0.859 41.547 091.547 00.193 20.155 4

福建龙海0.933 11.287 391.287 30.093 00.075 8

安徽牛庄0.928 81.303 991.303 90.099 60.081 1

四川宜宾南溪裴石0.898 71.458 691.458 60.143 00.117 4

广东湛江市遂溪0.933 11.265 291.265 20.090 30.072 8

安徽潭棚0.934 91.292 891.292 80.090 60.074 2

福建漳浦0.931 91.281 891.281 80.093 00.075 4

注：为了消除样本数量的影响，使结果具有可比性，海南和云南景洪的品种不参与比较。

图1 不同地理来源穿心莲的N-J聚类分析

Fig.1 Dendrogram of cultivars from different localities base on SRAP analysis

根据单株进行聚类，可分为3大类（图2），第1类包括70，71，79，93～95，其中70，71来自福建龙海，79来自福建漳浦，93～95来自广东雷州。第2类包括65～69，72，77，78，80～82，87～92，96，其中65～69，72来自福建龙海，77，78，80～82来自福建漳浦，87～91来自广东遂溪，92，96来自广东雷州。第3类包括的样品来自全部采样点。结果表明，103号样品的聚类与其地理分布并未表现出明显的相关性，每个地理分布区域内均存在各种类似的基因型，提示各地理分布区样品在基因型上并无明显的差异（图2）。

3.4 SNP分子标记分析 对34份来自不同产地的穿心莲样品进行特异性扩增，利用CodonCode Aligner软件对测序结果进行分析，并未发现文献[15]所报道的SNP位点，表明本研究使用的各穿心莲样品

图2 103份穿心莲的N-J聚类分析

Fig.2 Dendrogram of 103 cultivars base on SRAP analysis

在CPS基因所检测区段内未发生遗传分化。

4 讨论

一般来说，物种的起源地常常蕴藏着丰富的种质资源多样性。印度不但是穿心莲的起源地之一，还是该种的栽培植物起源中心地区之一。在形态学水平[10]、染色体水平[18]、DNA水平[9]和等位酶水平[5]上，印度国内的穿心莲种质资源均能够检测到较高的遗传多样性。另外，根据遗传背景相似度较高来推测，泰国和马来西亚的穿心莲可能均来源于印度[19-20]。先后有学者利用分子标记研究泰国分布的穿心莲的遗传多样性，其取样地覆盖了泰国全国各地，包括不同气候、土壤类型地区的样品，但仅检测到很少的多态性位点，整个群体表现出很低的遗传杂合度，且几种分子标记的检测结果高度一致。这些研究结果也为泰国产穿心莲可能来源于印度提供了证据，并表明，尽管在泰国具有较大地理跨度范围的各地经过长期的栽培，但也尚未产生明显的分化[15，21-23]。

有文献报道，我国部分地区有野生穿心莲分布[24-25];海南省是穿心莲的原产地之一，资源分布于全岛，在海南西部和西南部野生资源丰富[26]。但根据《中国植物志》记载，穿心莲属全世界约20多种，主要分布于亚洲热带地区的印度、缅甸、中南半岛、马来半岛至加里曼丹岛，模式种延至澳大利亚，印度为分布中心。中国有2种，栽培1种，野生1种（包括1个变种）。栽培种即穿心莲A. paniculata，野生种为疏花穿心莲A. laxiflora（又名白花穿心莲、须药草），变种为腺毛疏花穿心莲A. laxiflora var. glomerulifera[27]。文献报道对广东饶平、花都和湛江3个主产区的穿心莲的遗传多样性分析，在5SrRNA 基因间隔区DNA 序列组成上未检测到差异[28];52条RAPD分子标记引物中（样品产地），仅有4条能够检测到不同产地间的多态性[29]，表明所研究的穿心莲资源遗传背景相似度较高。本研究利用SRAP，SNP分子标记对7省区13样地103号穿心莲样品的遗传多样性分析，结果表明，SRAP分子标记扩增的多态性条带比率低，各省区穿心莲种质的遗传距离小，且未检测到CPS基因片段中的SNP位点，表明我国各地产穿心莲的遗传背景相似度高，资源遗传背景较窄，经过80年以上的引种栽培，也并未产生明显的遗传分化，与上述文献报道结果一致。但由于本研究中未采集到海南、云南等省的野生穿心莲样本，对于海南等地是否为穿心莲原产地，尚需采集当地野生种源，并与印度、泰国等的样本进行分析才能确证。

我国已在地理跨度较大、生态类型多样的范围内引种有穿心莲，但不同地区穿心莲种群群体的遗传多样性却低，主要有穿心莲生物学特性和引种栽培生产2个方面的原因，在生物学特性方面，穿心莲系一年生近交繁殖植物[30]，花两性，柱头和花药紧贴在一起，花药开裂与柱头授粉高度同步，在花朵完全开放之前就能够完成自花授粉过程，保证了穿心莲采用完全专性自交亲和的方式进行繁殖[31]，这种严格的闭花授精繁殖方式不仅阻碍了群体内因个体间的基因交流的遗传多样性发生，也使得因地域相隔较远的随机群体间发生基因漂移[6，32]、随机遗传漂变和可能发生的遗传瓶颈事件引起的群体间的分化[20，33]和种群间遗传结构差异增加的概率降低;在穿心莲的引种栽培生产方面，据调查，虽然全国各地在种植穿心莲时常交叉引种，但最初的种源多来源于广东、海南等地，种源仍较为单一，这种大范围内的种子流通、人工栽培虽然促进了种质交流，但自然选择会增加有利于提高物种适应性的等位基因频率，降低不利于物种适应的等位基因频率，反而可导致部分遗传多样性的丧失。

在植物界中，自花授粉的方式较为常见，但严格的闭花受精会使种群灭绝的风险大大增加[34]。穿心莲花器构造特点和自交高度亲和的特性不利于穿心莲的繁衍和进化，也使得穿心莲难以通过杂交创造新的种质[8，34-35]，开展良种选育。SRAP标记在基因组中常常分布均匀，但对基因相对较少的着丝粒附近和端粒的扩增较少，结合可扩增这些区域的SSR标记，便可获得覆盖全基因组的连锁图[36]。本研究筛选到的68对具有多态性的SRAP分子标记引物，对于鉴定穿心莲种质资源遗传背景、种质保护、构建穿心莲基因图谱、开展穿心莲标记辅助选择育种等具有重要的应用价值。

5 结论

本研究利用SRAP标记技术，对国内穿心莲的遗传多样性进行分析，获得了具有一定多态性、清晰的条带，表明该分子标记可以有效应用于穿心莲遗传背景研究。国内各地区穿心莲的遗传距离为0.01～0.09，均小于0.1，反映出我国不同产地的穿心莲种质间的遗传多样性较贫乏，SNP分析进一步佐证了这一结果，这与穿心莲严格的自花授粉繁殖特性、各地引种种植穿心莲的种源来源单一密切相关。本研究结果提示，遗传背景并非影响不同产地穿心莲质量差异的主要原因;同时，国内穿心莲种群的进化潜力有限，穿心莲的良种选育以采用突变育种、多倍体育种、标记辅助选择育种等方法为宜。

[致谢] 本研究样品采集工作由中国中医科学院中药资源中心道地药材国家重点实验室完成。

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Genetic diversity analysis of Andrographis paniculata in

China based on SRAP and SNP

CHEN Rong1，2， WANG Xiao-yun3，4，5， SONG Yu-ning3，4，5， ZHU Yun-feng3，4，5，

WANG Peng-liang6， LI Min3，4，5， ZHONG Guo-yue2，3，4，5*

（1.Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China;

2.State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijng 100700， China;

3.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330004， China;

4.Collaborative Innovation Center for the Modern Technology and Industrial Development of Jiangxi Minority

Traditional Medicine， Nanchang 330004，China;

5.Chinese Medicine Germplasm Resource Engineering Technology Research Center of Jiangxi Province，

Nanchang 330004， China;

6.Guangxi Academy of Forestry， Nanning 530022， China）

[Abstract] In order to reveal genetic diversity of domestic Andrographis paniculata and its impact on quality， genetic backgrounds of 103 samples from 7 provinces in China were analyzed using SRAP marker and SNP marker. Genetic structures of the A. paniculata populations were estimated with Powermarker V 3.25 and Mega 6.0 software， and polymorphic SNPs were identified with CodonCode Aligner software. The results showed that the genetic distances of domestic A. paniculata germplasm ranged from 0.01 to 0.09， and no polymorphic SNPs were discovered in coding sequence fragments of ent-copalyl diphosphate synthase. A. paniculata germplasm from various regions in China had poor genetic diversity. This phenomenon was closely related to strict self-fertilization and earlier introduction from the same origin. Therefore， genetic background had little impact on variable qualities of A. paniculata in domestic market. Mutation breeding， polyploid breeding and molecular breeding were proposed as promising strategies in germplasm innovation.

[Key words] Andrographis paniculata; sequence related amplified polymorphism; single nucleotide polymorphism; genetic polymorphism

doi：10.4268/cjcmm20142316