妊娠期糖尿病母婴血清及胎盘内脂素变化及其与胎儿生长发育的相关性研究

【摘要】 目的：探讨妊娠期糖尿病（GDM）母婴血清内脂素水平、胎盘及网膜脂肪组织内脂素基因表达及其与胎儿生长发育的关系。方法：采用双抗体夹心酶联免疫吸附法测定40例妊娠期糖尿病及55例正常孕妇母血清及新生儿脐血血清中内脂素水平；采用实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）检测两组胎盘及网膜脂肪组织内脂素mRNA的表达。结果：（1）GDM组孕妇产前BMI、孕期体重增长、新生儿出生体重高于对照组，差异有统计学意义（P

【关键词】 内脂素； 妊娠期糖尿病； 胰岛素抵抗； 胎盘； 脐血

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是威胁孕妇、新生儿健康的常见妊娠期并发症，可引起妊娠期高血压疾病、巨大儿、胎儿宫内窘迫和新生儿低血糖等，并可增加子代成年后罹患代谢综合征的风险。妊娠期糖尿病发病率有逐年上升的趋势，但其发病机制尚未完全明了。原有理论认为胎盘分泌的激素，如雌激素、孕激素、胎盘泌乳素（HPL）等对胰岛素的拮抗是导致GDM发生的原因之一。近年来研究表明，脂肪组织能分泌一类具有影响胰岛素敏感性和血糖稳态作用的因子，称为脂肪细胞因子（adipocytokines）。妊娠期胎盘同样能够分泌多种脂肪细胞因子，并参与GDM的发生。其中内脏脂肪素（visfatin）与胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）、妊娠期糖尿病的关系备受关注。本研究检测GDM患者母血和脐血血清内脂素水平，研究GDM患者胎盘组织及网膜脂肪组织中内脂素基因表达的变化，旨在探讨内脂素与GDM发病及其与新生儿生长发育的相关性。现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年1-6月在本院产科定期产检并住院分娩的足月孕妇，参照2011年ADA诊断标准，将孕24～28周诊断为GDM的40例孕妇作为研究组（GDM组），随机选取同期正常孕妇55名作为对照组。所有研究对象均为单胎妊娠，于37～42周终止妊娠。两组受试者均无心血管病、无高血压疾病、无肝肾疾病、无感染、无孕前糖尿病以及甲状腺疾病，定期行常规产前检查直至分娩，且孕期唐氏筛查和三维超声提示低风险。告知患者本项研究相关内容、签署知情同意书，并取得本院医学伦理委员会许可。两组孕妇的年龄、孕次、产次、分娩孕周、孕前BMI比较差异无统计学意义（P>0.05）；GDM组孕妇产前BMI、孕期体重增长、新生儿出生体重高于对照组，差异有统计学意义（P

1.2 研究方法

1.2.1 临床指标的测定 所有研究对象分娩前记录年龄、孕周、孕次、产次；测量身高、体重（脱鞋、免冠，仅穿内衣裤测量），计算体质量指数[BMI=体重（kg）/身高2（m2）]；询问孕前体重，计算孕前BMI及孕期体重增长。新生儿出生后，记录性别、出生体重、身长、头围、胸围，用于判断新生儿的营养状况。

1.2.2 血清及组织标本的收集 （1）于分娩前1～3 d清晨采集孕妇空腹静脉血5 mL，2000 r/min离心10 min，分离出血清；新生儿娩出后断脐前抽取脐静脉血5 mL，方法同上分离出血清，放置于-80 ℃冰箱保存，待统一检测血清内脂素水平。（2）胎盘娩出后立即在无菌条件下选取母体面中央并避开钙化灶，手术刀切取约1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm大小的胎盘组织2块，无菌生理盐水冲洗后立即投入液氮中速冻，然后转移到-80 ℃低温冰箱中保存用于总RNA提取。（3）所有研究对象如果行剖宫产术分娩，于术中取1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm大小的网膜脂肪组织2 块，去除肉眼可见的血管和血块，无菌生理盐水冲洗，同胎盘组织标本方法保存。

1.2.3 血清内脂素测定 采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）测定母血和脐血血清内脂素水平，内脂素试剂盒购自美国R&D公司，批内差异

1.2.4 实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）检测内脂素mRNA表达

1.2.4.1 总RNA提取 取面积为0.5 cm×0.5 cm大小的组织样本在低温液氮环境下研碎，用Trizol（Invitrogen）法提取总RNA。脱氧核糖核酸酶Ⅰ去除混杂的基因组DNA。NanoDrop测定RNA浓度，测得所提取的RNA OD 260/OD 280在1.8～2.0之间。1%琼脂糖凝胶电泳见28、18 s和5 s RNA条带清晰，表明RNA相对分子纯度良好，无降解。

1.2.4.2 Real-time PCR反应 参照逆转录试剂盒（Takara）操作说明书合成10 μL cDNA，采用两步法Real-time PCR试剂盒（SYBR Green）（Takara）扩增内脂素及内参磷酸甘油脱氢酶（GAPDH）基因片段。内脂素基因扩增引物序列，上游：5’-TGGAAACCCTCTTGACTGTGT-3’，下游：5’-GACGTTAATCCCAAGGCCATTAG-3’，PCR扩增片段长度为298 bp。内参照GAPDH 引物序列，上游：5’-CTTAGCACCCCTGGCCAAG-3’，下游：5’-GATGTTCTGGAGAGCCCCG-3’，PCR扩增片段长度为146 bp。所需引物均由上海生工生物工程有限公司合成。循环条件为95 ℃ 10 min，然后95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，共40个循环。使用Roche 480实时荧光定量PCR仪测出样品内脂素及GAPDH的Ct值。用双Ct法计算内脂素mRNA相对于GAPDH的丰度。

1.3 统计学处理 使用SPSS 16.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，以P

2 结果

2.1 两组孕妇血清及新生儿脐血内脂素水平比较 GDM组孕妇血清内脂素水平显著高于对照组，差异有统计学意义（P

2.2 两组胎盘组织和网膜脂肪组织内脂素mRNA表达水平比较 实时荧光定量PCR数据显示内脂素mRNA在两组胎盘组织样本中均能检测到，熔解曲线均为单峰。GDM组Ct值为（2.395±0.302），对照组为（5.028±1.179）；将两组样本Ct的均数进行t检验，差异具有统计学意义（P0.05）。

3 讨论

GDM是指妊娠期首次发生或发现的糖代谢异常，一般可在产后恢复正常。IR是GDM重要的发病环节，目前研究认为胎盘分泌的激素以及脂肪组织分泌的细胞因子与孕期IR有关，并可能在GDM发生过程中发挥着重要作用[1]。

内脂素在1994年首次被发现，曾被命名为前B细胞克隆增强因子（pre-B-cell colony-enhancing factor，PBEF）[2]，之后，此蛋白又被鉴定为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸生物合成中的限速酶，命名为烟酰胺磷酸核糖基转移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase，Nampt）[3]。2005年，Fukuhara等[4]发现此蛋白在内脏脂肪组织中高表达，故命名为内脏脂肪素，简称内脂素。内脂素的一大特点是具有拟胰岛素作用，且具有剂量依赖性。妊娠期是孕龄妇女脂肪组织和体重增加最快的时期，适度增加的脂肪组织有利于胎儿的正常发育。普遍认为，妊娠期血清或血浆内脂素水平会增高[5-6]。妊娠期内脂素合成和分泌来自两个方面。一方面，内脏脂肪组织能够产生内脂素，另一方面，胎盘和胎膜也能产生内脂素[5，7]。内脂素在妊娠期有3个作用：母儿葡萄糖转运、对抗胰岛素抵抗、预测胰岛素敏感性[5]。

妊娠期糖尿病作为一种妊娠期代谢综合征，常常与肥胖、脂肪过度堆积等相关联，但GDM孕妇内脂素水平的变化存在争议。一方面，有研究认为GDM孕妇循环内脂素水平低于正常孕妇，这些学者认为内脂素低水平是引起GDM胰岛素抵抗的原因之一[6，8-10]。本研究中笔者对比40例妊娠期糖尿病患者和55名健康孕妇静脉血清中的内脂素水平发现，GDM患者循环中内脂素的水平高于正常孕妇，GDM患者胎盘组织中内脂素mRNA表达也较正常孕妇增加，差异均有统计学意义（P

笔者的研究发现GDM组孕期体重增加量和分娩时BMI明显高于对照组，提示GDM患者孕期的体重过度增加可能与Visfatin的水平上升相关。GDM患者存在严重的胰岛素抵抗，刺激脂肪组织及胎盘产生更多量的内脂素，内脂素有“类胰岛素样作用”调节体内血糖、血脂代谢。同时内脂素通过自分泌和旁分泌方式又促进了前脂肪细胞分化成熟，促进葡萄糖转运及脂肪生成和积聚加剧了内脏脂肪的积聚[14]。由此，笔者认为GDM孕妇内脂素的异常升高与孕期体重增加过多存在密切关系。

另外，笔者的研究证实GDM组脐血中内脂素水平显著高于对照组，推测高内脂素是GDM易产生巨大儿的原因之一。Malamitsi-Puchner等[15]研究发现，脐血内脂素水平与母血水平相似，两者有明显相关性，提示胎儿血循环中内脂素可能主要来自母体。而Mazaki-Tovi等[16]也认为GDM产妇和巨大儿均是孕期母体高内脂素的独立相关因素。

综上所述，在GDM复杂的发病机制中，内脂素可能参与了孕妇血糖的调节，与GDM的发生发展及胎儿的宫内发育的调节有关。但其具体的作用通路有待于进一步的研究，明确内脂素在能量代谢、炎症反应等方面的生物学功能，结合其他脂肪细胞因子的改变，有利于揭示脂肪因子与GDM的关系。

参考文献

[1] Harlev A，Wiznitzer A.New insights on glucose pathophysiology in gestational diabetes and insulin resistance[J].Curr Diab Rep，2010，10（3）：242-247.

[2] Hausenloy D J.Drug discovery possibilities from visfatin cardiop rotection？[J].CurrOp in Pharmacol，2009，9（2）：202-207.

[3] Rongvaux A，Shea R J，Mulks M H，et al.Pre-B-cell colony-enhancing factor， whose expression is up regulated in activated lymphocytes， is a nicotinamide phosphoribosyltransferase， a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis[J].Eur J Immunol，2002，32（11）：3225-3234.

[4] Fukuhara A，Matsuda M，Nishizawa M，et al.Visfatin： a protein secreted by visceral fat that mimics the effects of insulin[J].Science，2005，307（5708）：426-430.

[5] Morgan S A，Bringolf J B，Seidel E R.Visfatin expression is elevated in normal human pregnancy[J].Pep tides，2008，29（8）：1382-1389.

[6] Telejko B，KuzmickiM，ZonenbergA，et al.Visfatin in gestational diabetes： serum level and mRNA expression in fat and placental tissue[J].Diabetes Res Clin Pract，2009，84（1）：68-75.

[7] Ognjanovic S，Bryant-Greenwood G D.Pre-B-cell colony-enhancing factor， a novel cytokine of human fetal membranes[J].Am J Obstet Gynecol，2002，187（4）：1051-1058.

[8] Chan T F，Chen Y L，Lee C H，et al.Decreased plasma visfatin concentrations in women with gestational diabetes mellitus[J].J Soc Gynecol Investig，2006，13（5）：364-367.

[9] Haider D G，Handisurya A，Storka A，et al.Visfatin response to glucose is reduced in women with gestational diabetes mellitus[J].Diabetes Care，2007，30（7）：1889-1891.

[10] Akturk M，Altinova A E，Mert I，et al.Visfatin concentration is decreased in women with gestational diabetes mellitus in the third trimester[J].J Endocrinol Invest，2008，31（7）：610-613.

[11] Krzyzanowska K，Krugluger W，Mittermayer F，et al.Increased visfatin concentrations in women with gestational diabetes mellitus[J].Clin Sci （Lond），2006，110（5）：605-609.

[12] Lewandowski K C，Stojanovic N，Press M，et al.Elevated serum levels of visfatin in gestational diabetes： a comparative study across various degrees of glucose tolerance[J].Diabetologia，2007，50（5）：1033-1037.

[13] Winkler G，Cseh K，Baranyi E，et al.Tumor necrosis factor system in insulin resistance in gestational diabetes[J].Diabetes Res Clin Pract，2002，56（3）：93-99.

[14] Berndt J，Kioting N，Kralisch S，et al.Plasma visfatin concentrations and fat depot-specific mRNA expression in humans[J].Diabetes，2005，54（10）：2911-2916.

[15] Malamitsi-Puchner A，Briana D D，Courgiotis D，et al.Blood visfatin concentrations in normal full-term pregnancies[J].Acta Paediatr，2007，96（12）：526-529.

[16] Mazaki-Tovi S，Romero R，Kusanovic J P，et al.Visfatin in human pregnancy： maternal gestational diabetes vis neonatal birthweight[J].J Perinat Med，2009，37（3）：218-223.

（收稿日期：2014-01-21）（本文编辑：蔡元元）