杜仲再生体系优化

摘要：对杜仲再生体系中不同途径愈伤组织的诱导、增殖、分化、茎段腋芽萌发、增殖、生根培养基激素组合进行了一系列优化试验。试验表明：叶片愈伤组织诱导的激素最佳组合及配比是NAA浓度为1.5mg/L，BA浓度为2.0mg/L，诱导率达94.4%；最佳增殖培养基的组合及配比是MS+NAA 1.0mg/L+BA 0.5mg/L等几组，诱导不定芽的培养基以MS+NAA 0.5mg/L+BA 2.0mg/L为宜，诱导率达83%；在附加NAA 0.2mg/L+BA1.0mg/L的MS基本培养基上外植体腋芽生长状况最佳，萌发率达98%；在附加1/4MS+IBA 2.0mg/L的茎段生根培养基上，生根率达43.3%。

关键词：杜仲；组织培养；优化

组织培养可为遗传育种工程提供理想的受体材料，又可为常规植物品种改良提供新的途径。杜仲树生长周期较长、树体高大、用于操作的群体数目相对较小，如果采用常规的方法进行改良育种很难操作。当前在杜仲组织培养方面已经有了很多研究成果，但出根和出芽率不高成为影响杜仲组织培养的主要原因。本试验以组织培养技术为基础，较为详细地研究了影响杜仲不同外植体愈伤组织的诱导、增殖和分化的因素，有效提高了其生根生芽率，目的在于为杜仲的组织培养和细胞培养提供参考依据。

1材料与方法

1.1材料

杜仲健康的单株幼嫩枝条（陕西省西北农林科技大学西林校区）和当年采集的成熟翅果。本试验使用的仪器主要有FA104型电子天平、超净操作台、高压灭菌锅等。采集当年生新鲜、健康无损的幼嫩叶片，先用流动的自来水彻底清洗并流水冲洗5h，然后先用75%的酒精浸泡60s消毒、无菌水冲洗5～6次，再用0.1%的氯化汞浸泡7～8min，再用无菌蒸馏水冲洗5～6次后备用。

采集当年生新鲜、健康无损的嫩茎（剪除叶柄及叶片）切成4cm左右（带1个腋芽）的茎段，加入有10ml/L清洗剂水烧杯中洗涤浸泡10min后，置于烧杯中用流水冲洗2h，然后放入干净的容器中加入75%酒精摇动杀菌2min，再用蒸馏无菌水冲洗3～4次，用0.1%的氯化汞充分浸泡10min，再用无菌水冲洗4～5次后备用。

1.2培养基的制备及灭菌

采用MS培养基（30g/L蔗糖，以6g/L琼脂固化）。先在微波炉内中高火加热25min，使蔗糖和琼脂充分溶解，加热开始15min时，用玻璃棒搅拌使其能够充分溶解，取出后将pH值调至5.8，根据不同的培养目的，再加入不同种类和浓度的植物生长调节物质。趁热分装时不能沾到瓶口或内壁上，以防止后期出现污染。培养基分装后应立即用膜封口并进行高压灭菌。高压灭菌采用121℃，时间为20min。所用培养基瓶规格为50mL，分装用瓶25mL，封口只用单层封口膜。

工具的灭菌注意：将清洗干净晾干后的容器及接种工具，用牛皮纸包好用高压灭菌锅灭菌。注意在超净工作台接种操作时应用75%的酒精浸泡接种工具，并在酒精灯上反复灼烧灭菌。

配制溶液注意：（1）在配制大量元素以及微量元素母液时，为了防止产生沉淀，各种盐类必须在充分溶解后才能混合，混合时要注意先后次序。（2）铁盐类需单独配制。（3）生长调节物质可配成母液，但浓度不能太大。由于其不溶于水，配制时应根据种类不同用95%酒精或稀酸、稀碱液先溶解，再定容。（4）配好的各类母液贴上标签，在2～4℃的冰箱中储存。

1.3试验方法

进入接种室前应用紫外灭菌灯照射1h以上，严格按照操作程序操作，结束后做好标记，注明接种日期、名称等，立即拿到培养室定期观察，及时处理受污染的材料，观察生长情况并做好记录。

1.3.1以嫩叶为材料。（1）愈伤组织的诱导和增殖。把新鲜嫩叶切成0.5cm×0.5cm的方片，叶片正面朝上，置于附加植物生长调节物质的MS培养基上。NAP，的浓度依次为0.5、1.0、1.5、2.0mg/L，BA的浓度依次为0.5、1.0、1.5、2.0、3.0mg/L（见表1）。每瓶接2～3块，每个处理约35瓶，置于24～26%，12h光照、12h黑暗条件下进行培养。一段时间后，挑选颜色嫩黄、生长旺盛的愈伤组织，切成大小一致的小片，接种于附加生长调节物质的培养基上，NAP，的浓度为0.5、1.0、1.5mg/L，BA的浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、3.0mg/L（见表2）。每瓶接3～4片，每个处理接种60瓶，放置在25%，12h光照12h黑暗的培养室。（2）不定芽的诱导。将培养好的愈伤组织接人附加植物生长调节物质的培养基中，NAP，的浓度为0.5mg/L，BA的浓度为1.0、1.5、2.0、2.5mg/L（见表3），进行不定芽的诱导。每瓶接2～3块，每个处理约70块，置于25%，12h光照、12h黑暗条件下进行培养。

1.3.2以茎段为材料。（1）腋芽的萌发。将准备好的茎段接种于附加、生长调节剂的MS培养基上（见表4），NAP，的浓度为0.05、0-1、0.2mg/L，BA的浓度为0.5、1.0、1.5mg/L，注意采用竖插的方式，茎段的植物学上端朝上，每瓶接3～4个，每个处理接45瓶。（2）枝条的增殖。将初代培养中腋芽萌发形成的幼嫩枝条转入茎芽增殖培养基中（NAA0.1mg/L，BA1.0mg/L），诱导其再萌发出新枝条或从基部产生丛生芽。（3）枝条的生根。以增殖培养中的无菌短枝为材料，将无菌短枝基部用100 mg/LNAA浸蘸4-6s，然后扦插在不同种类浓度激素的MS培养基上（见表5）进行生根培养。

2结果与分析

2.1杜仲叶片愈伤组织的诱导

外植体接种在MS（添加了不同种类和浓度的激素）培养基上，大概在2周后叶片开始变厚膨大，形成绿色的愈伤组织，并按下式计算诱导率：统计结果（见表1）。

诱导率=（形成愈伤组织的外植体块数，接种的外植体块数）×100%

由表1得出，加入了NAP，与BA的组合对叶片愈伤组织的诱导效果良好。但是添加不同种类和浓度的激素对其诱导效果有差异。NAA浓度在1.0～2.0mg/L，BA浓度在1.5～3.0mg/L对叶片愈伤组织诱导率效果较好，其中当NAA浓度为1.5mg/L，BA浓度为2.0mg/L时诱导率最高，达到94.5%。

2.2愈伤组织的继代增殖

由表2中数据可知：当BA≥3.0mg/L时愈伤组织增殖率为0。当BA在0.5～3.0mg/L时增殖效果最为理想。NAP，为0.Smg/L，BA为1.0～2.0mg/L，愈伤组织分化出芽。增殖培养基的最佳组合为2、3、4、6、9、13号培养基。

2.3愈伤组织不定芽的诱导

将增殖后的愈伤组织转入诱导丛生芽培养基，大约38d后在愈伤组织表面形成了许多丛生芽突起。从表3可以看出，NAA与BA对不定芽的诱导效果良好，诱导率在40%以上。并且在NAA0.5mg/L、BA 2.0mg/L时对不定芽的诱导率高达83%。将丛芽复壮培养生长到4cm左右高时即可诱导生根。

2.4茎段腋芽的萌发

带芽茎段两端在培养2周左右也出现颗粒状愈伤组织。在初代培养中，腋芽能否顺利萌发与培养基中外源激素的种类和浓度有很大关系。表4为不同激素组成对腋芽萌发的影响。

由表4，当NAA0.2mg/L、BA1.0mg/L时，腋芽的萌发率最高达到98%。在取材时机适合的前提下，即使是不添加任何激素或只添加极低浓度的激素，腋芽萌发率也达到80%以上。

2.5增殖培养

将初代培养中的茎段切下来转入无激素培养基后腋芽不发育切生长缓慢，当转入增殖培养基MS+BA 1.0mg/L+NAA0.1mg/L中的枝条生长状况良好，其腋芽萌生细弱的新枝或基部同时萌发出4～6个约2～3cm的丛生芽。

2.6生根培养

通过增殖培养形成的茎段较细，生根率较低，生根后很难成活，因此，生根前需要进行壮苗培养。壮苗培养基的组合为MS+NAA 0.5mg/L+BA 2.0mg/L。将切割下来经过壮苗培养的腋芽并转人生根培养基，约2周后陆续生根，且根较粗，呈乳白色。表5列出了在不同无机离子强度和附加成分下的生根率。

前人试验的结果曾经表明，当ABT-1生根粉的浓度为0.5mg/L时，诱导生根的效果最好。但是从表5可以看出，在培养基中添加IBA2.0mg/L的生根率更高，最高达43.4%，而且培养基中无机盐强度影响生根率。当培养基中附加成分相同时，枝条生根率随无机盐浓度降低而增高。

3结论

杜仲愈伤组织的诱导和增殖结果受培养基和外植体条件的共同影响。其中培养基最佳激素组合和配比的筛选是组织培养中关键的技术。由试验结果可知，叶片愈伤组织诱导的激素最佳组合是NAP，1.Smg/L、BA 2.0mg/L，诱导率高达94.4%；最佳增殖培养基的组合及配比是MS+NAA1.0mg/L+BA0.5mg/L等几组；诱导不定芽的培养基以MS+NAA 0.5mg/L+BA2.0mg/L为宜，诱导率达83%；在附加NAP，0.2mg/L+BA1.0mg/L的MS基本培养基上腋芽的生长状况最佳，萌发率达98%；在附加1/4MS+IBA2.0 mg/L的茎段生根培养基上，生根率达43.4%。在以幼嫩叶片作为外植体时，在3月中旬幼叶刚展开时采叶比较好，因为此时幼叶刚萌发，污染小，试验结果证明诱导率也高，从接种到转接大概只需24d。而对于幼嫩茎段，在3月中旬采集时，虽然诱导率较高，培养时间仅需12d就可转接，愈伤组织生长较好，但采集过多会影响母树的生长，如果过晚采集，虽然也是先端幼嫩枝条，但污染率太高，诱导率降低，而且此时诱导出的愈伤组织也不利于继代生长。