玉米种质资源RAPD分子标记优化体系的建立

摘要：玉米是我国重要的作物之一，在我国农业生产中占有重要的地位。吉林省玉米生产条件优越，推广面积广，品种的多样性丰富，为实现品种的管理高效科学，本实验以用玉米为材料进行RAPD的研究。建立并优化了高效、稳定的玉米RAPD实验体系，为后续玉米品种的管理提供了理论基础和实验支持。

关键词：玉米；RAPD；体系

中图分类号：S513 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2012）-10-0050-1

RAPD（random amplified polymorphic DNA，RAPD）也称之为AP-PCR（Arbitrary Primer PCR），即随机扩增多态性DNA技术，是由Williams和Welsh等发明的分子标记技术，是一项基于PCR技术的分子生物技术[1，2]。是以基因组DNA为模板，常以一个10mer随机的寡核苷酸序列作引物，通过PCR扩增，产生许多不连续的DNA产物，以检测DNA序列的多态性。它可以在物种遗传背景没有任何分子生物学研究的情况下，对其进行基因组指纹图谱进行研究，还可用于检测体细胞杂种和微生物分型[3]。

玉米是最为古老的栽培作物之一，目前为我国栽培作物的第二位。吉林省是我国的玉米大省，玉米种植面积在全国位于前五，每年审定的新品种数目为全国第一。由于目前玉米为品种检定手段还不完善，导致品种管理有一定的难度。故本文进行了玉米RAPD分子标记体系的相关研究。

1 材料与方法

1.1 供试材料

购买市售玉米主推品种种子。

1.2 试验试剂和仪器

TaqDNA聚合酶、10×PCR buffer（含Mg2+）、10碱基随机引物、dNTPs；琼脂糖、DNA分子量标准（D2000Maker）等购自上海生工。

1.3 RAPD方法

1.3.1 DNA的提取 以玉米种子产生的嫩芽为材料，使用植物基因组试剂盒提取。DNA回溶于灭菌水中，-20℃保存备用，1%琼脂糖凝胶电泳检测质量。

1.3.2 RAPD条件及扩增程序 根据王志刚[4]RAPD反应体系文献，玉米RAPD初始25μL反应体系包括：2.5μL 10×PCR Buffer、0.2μmol·L-1引物、0.5U Taq DNA聚合酶、0.1 mmol·L-1dNTPs、20ng模板DNA，用ddH2O补齐反应体系到25μL。

RAPD-PCR扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性50s，38℃退火40s，72℃延伸90s，35个循环，72℃后延伸10min，4℃保存。

1.3.3 RAPD反应体系优化 模板DNA浓度，TaqDNA聚合酶浓度、引物浓度、dNTP定量对影响RAPD反应结果影响较大须进行优化。本试验将各种影响因素设置梯度，并进行正交实验，对各个相关参数进行了优化，以建立较为完善的反应体系和程序。

1.3.4 RAPD产物检测 取5μl扩增产物，在1.5%琼脂糖凝胶上进行检测。凝胶成像分析系统照相保存数据并分析结果。

1.3.5 引物的筛选 将所选择的样品提取的DNA等量的混合，作为筛选引物的 DNA为模板。并对购买的100个随机引物分别进行相同条件的RAPD扩增，初步筛选出若干个多态性引物。再经过二次筛选，选取扩增DNA条带型清晰、差异性和多态性好的引物。最后确定出最佳的随机扩增引物。

2 结果

2.1 基因组DNA提取质量的检测

本试验使用试剂盒提取玉米基因组DNA，以1%的琼脂糖凝胶上检测，结果如图1所示。

图1 玉米基因组电泳检测结果

从图中可以看出，主带清晰，无拖带现象，间亮度均一，一般每克材料提取DNA产量在30～40?g之间。说明提取基因组DNA质量好，产率高，完全满足RAPD反应体系的要求。

2.2 引物的筛选

通过实验从100个随机引物中，筛出22个扩增条带清晰，多态性好的引物。图2为部分实验结果。

图2 玉米RAPD部分实验结果

2.3 RAPD反应体系

通过实验对影响RAPD扩增结果的因子进行研究筛选，并对其影响因素进行了优化，筛选出了最合适玉米的RAPD条件，并利用该体系对所选的材料进行扩增，得到了清晰、多态性高的谱带，具有较好的重复性，说明该体系稳定可靠，适合于玉米的研究。

参考文献

[1] 李明芳，郑学勤.荔枝SSR标记的研究.遗传，2004，26（6）：

911-916.

[2] 洪丹丹，王正加，黄坚钦.山核桃SSR反应体系优化.西南林学院学报，27，1：51-54.

[3] 代汉萍，雷家军，邓明琴.长白山野生草莓资源的调查与分类研究.园艺学报，2007，34（1）：63-66.

[4] 王志刚，张志宏，李贺，等.利用rapd和SCAR标记鉴定草莓品种.园艺学报，2007，34（3）：591-596.

作者简介：李树国（1956-），男，吉林农业工程职业技术学院教授，研究方向：粮食学与生物化学。