鸡卵清蛋白基因5’端调控区序列表达载体的构建

摘 要 本研究从鸡输卵管组织中扩增并克隆了约1400bp的鸡卵清蛋白基因5’端调控序列。经测序结果和序列分析表明其具有调控外源基因在输卵管内表达的能力，并构建了鸡卵清蛋白基因5’端调控序列调控外源基因表达载体PVAX1-OVP。

关键词 鸡卵清蛋白基因；5’端调控序列；克隆；表达载体

中图分类号 Q95 文献标识码A 文章编号 1674-6708（2014）114-0143-02

卵清蛋白是鸡输卵管组织特异性表达产物，在鸡蛋白蛋白中含量可达重量比的65%， 在产蛋母鸡输卵管管状腺体细胞总合成蛋白中占55%～60%；在成鸡输卵管管状腺体细胞中主要白蛋白的合成超过了总翻译能力的70%。由于鸡卵清蛋白基因在鸡输卵管组织中的高效表达，因此鸡卵清蛋白基因5’端调控序列常用于鸡输卵管组织外源基因表达载体的构建和鸡输卵管生物反应器的研究中，以期高效启动合成外源蛋白。本研究克隆了鸡卵清蛋白基因5’端调控序列（约1400bp ），并构建了表达载体PVAX1-OVP。以为鸡输卵管生物反应器的研制以及进一步转基因鸡的研究奠定基础。

1 材料

大肠杆菌菌株DH5α（本实验室保存）；克隆载体pMD19一T购自TaKaRa公司； 限制性内切酶（ 购自Promegar公司）； T4-DNA连接酶、Blend Taq酶、dNTP、MarkerDL一2000、MarkerDL一15000（购自日本TaKaRa公司）；基因组DNA提取试剂盒（购自天根公司）；

引物由奥科合成：

引物1 ：5'-tgggaagcacatctatcatcac- 3' ，

引物2 ：5'-agaaggtaattccagagagttgc-3' ；

引物3 ：5'-ACGCGTGCACATCTATCATCA-3'（含MluI酶切位点），

引物4 ：5'-GGTACCAAGGTAATTCCAGAGAGTT-3'（ 含Acc65I 酶切位点）。

2 方法与结果

2.1 鸡输卵管组织DNA的提取

取产蛋鸡输卵管膨大部组织约30mg，剪碎研磨，将研磨液放入1.5ml离心管中，加入200μl蛋白酶K溶液，56℃放置3个小时，按基因组DNA提取试剂盒说明书步骤操作，提取鸡输卵管组织总DNA。

2.2 鸡卵清蛋白基因5’端调控序列扩增克隆

从鸡输卵管组织总DNA中，用引物1与引物2扩增鸡卵清蛋白基因5’端调控序列 ，采用100μl扩增条件如下：模板 5μl，dNTP 5μl， blend Taq buffer（包含MgCl2）10μl，blend Taq 酶 1.25μl，引物1 与引物2 各2.5μl，双蒸水73.75μl。反应条件如下：1） 94℃变性5 min；2）进入循环（30个：94OC变性45s，60OC复性45s，72℃延伸 1min 45s；3）最后72℃延伸10 min， 4℃保存。用1%琼脂糖凝胶进行检测，结果见图1，符合预期的片段长度（1374bp）：

图1

经琼脂糖凝胶电泳，用回收试剂盒纯化回收1400bp的DN段，再用引物3与引物4进行扩增，得到含酶切位点的鸡卵清蛋白基因5’端调控序列约1400bp，再经琼脂糖凝胶电泳，纯化回收含酶切位点的DN段，将纯化后的含酶切位点的DN段与PMD19-T载体在4℃连接过夜，将连接产物转化DH5α感受肽细胞中，涂含卡那霉素的LB板。挑取长势良好的菌落接种于含卡那霉素的LB培养液中培养，菌液鉴定正确后抽质粒（命名为OVP-T），送质粒测序。菌液鉴定结果见图2：

图2

2.3 鸡卵清蛋白基因5’端调控区调控外源基因表达载体的构建

将测序正确后的含鸡卵清蛋白基因5’端调控序列的质粒OVP-T， 用限制性内切酶MluI和Acc65I双酶切，得到鸡卵清蛋白基因5’端调控序列。用限制性内切酶MluI和Acc65I将PVAX1载体双酶切，切除PVAX1载体上原有的CMV启动子。回收酶切后的质粒OVP-T的小片段和质粒PVAX1的大片段，用T4 DNA连接酶连接，得到鸡卵清蛋白基因5’端调控区调控外源基因表达载体PVAX1-OVP。将重组质粒PVAX1-OVP 用内切酶MluI和Acc65I进行双酶切后，酶切产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测时，可得到两条电泳条带，一条为2400bp左右，与预期的2317bp相符；另一条为1400bp，与预期的1383bp相符（见图3）。

图3

2.4 重组质粒OVPVAX的测序测定与分析

对经PCR鉴定、酶切鉴定的重组质粒PVAX1-OVP进行测序，测序用DNAStar软件分析，结果表明，OVP基因已准确无误地连接到质粒载体PVAX1的酶切位点MluI和Acc65I之间，重组质粒PVAX1-OVP构建成功。

3 讨论

本研究扩增的鸡卵清蛋白基因5’端调控序列（约1400bp）测序结果与国外已发表序列（J00895.1）相比较，虽然有8处碱基发生了变化，但转录起始位点、-30区的TATA框、-878～-700区的TATA样框序列、-870～-780区的激素依赖性调控元件没有发生变化。因此本研究克隆的鸡卵清蛋白基因5’端调控序列作为表达调控元件并不影响其调控功能，用其构建的外源基因表达载体PVAX1-OVP可以用来在输卵管中表达外源基因。

参考文献

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