高效液相色谱测定葛根芩连丸中葛根素的含量

摘要：目的 建立高效液相色谱测定葛根芩连丸中葛根素含量的方法。方法 色谱柱：Diamonsil C18 （250x4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（15：85）；流速：1 mL/min；波长：250 nm；柱温：30℃。结果 葛根素浓度在2.0～50.0 μg/mL（r=0.9999）范围内线性关系良好，平均回收率为99.8%（RSD=1.03%）。结论 建立的方法简便、准确可靠，可用于葛根芩连丸中葛根素含量测定。

关键词：葛根芩连丸；葛根素；高效液相色谱

Determination of Puerarin in Gegen Qinlian Pellets by HPLC

HE Xin-xin

（Zhejiang Province Taizhou Luqiao Chinese Medicine Hospital， Taizhou， Zhejiang 318050， China）

Abstract：Objective To establish a HPLC method for determination of puerarin in Gegen Qinlian pellets. Method Chromatographic column： Diamonsil？ C18 （250x4.6 mm，5 μm）； mobile phase： methanol-water（15：85）； flow rate： 1.0 mL・min-1； detection wavelength： 250 nm；column temperature： 30 ℃. Result Puerarin showed a good linear relationship at the range of 2.0～50.0 μg・mL-1（r=0.9999）.The average recovery of puerarin was 99.8%（RSD=1.03%）. Conclusion This method is simple，reliable and Reproducible， can be used for quality control of the Gegen Qinlian pellets.

Key words：Gegen Qinlian pellets； Puerarin； HPLC

葛根芩连丸收载于2010版《中国药典》一部，处方出自东汉医圣张仲景《伤寒论》"葛根芩连汤"，由葛根、黄芩、黄连、炙甘草组成，具有解肌、清热、止泻止痢等功效。用于泄泻痢疾、身热烦渴、下痢臭秽；菌痢、肠炎等症[1]。葛根素的含量测定已有报道[2-4]，本文借鉴报道，建立高效液相色谱测定葛根芩连丸中葛根素含量的方法，简便、准确、可靠，可用于葛根芩连丸中葛根素含量测定。

1仪器与试药

1.1仪器 Agilent 1100液相色谱仪，包括G1311A四元泵，G1313A自动进样器，G1322A脱气机，G1314A紫外可见检测器，G1316A柱温箱（美国安捷伦公司）；岛津UV-260紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；CP225D型电子天平（德国Sartorius公司）；SIGMA HSK1-18K高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；USC-512超声器振荡器（上海波龙公司）；XW-80A涡旋混合器（上海医科大学仪器厂）；YB-1A真空恒温干燥箱（天津金州科仪厂）。

1.2试药 葛根芩连丸3批（批号：20101101，20110111，20110226，广西壮族自治区花红药业股份有限公司）；葛根素对照品（批号：110752-200912，中国药品生物制品检定所）；甲醇为色谱纯、水为重蒸水、其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18 （250×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（15∶85）；流速：1 mL/min；波长：250 nm；柱温：30℃；进样量：20 μL。

2.2对照品溶液制备 精密称取葛根素对照品适量，用40%乙醇溶解，稀释，摇匀。制成每1 mL中含葛根素500 μg。

2.3供试品溶液制备 取本品适量，研细，取约1.0 mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入40%乙醇50 mL。称定重量，超声处理（250V50Hz） 40min，放冷，再称定重量，用40%乙醇补足减失的重量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.4阴性对照品溶液制备 按葛根芩连丸的处方，取除葛根外的所有药材，得葛根芩连丸阴性样品，取阴性样品1.0 g，按"2.3 供试品的制备"方法的阴性溶液。

2.5方法学考察

2.5.1方法专属性 按"2.1 色谱条件"测定，结果表明理论板数按葛根素峰计算应不低于3000，见图1。

图1 葛根芩连丸中葛根素含量测定色谱图

注：A. 阴性溶液；B.对照品溶液；C.样品溶液；1.葛根素

2.5.2线性关系 精密吸取0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分别置50 mL容量瓶中，稀释至刻度。吸取 20 μL注入液相色谱仪，记录峰面积，以浓度为x轴，峰面积为y轴，进行线性回归，葛根素的回归方程为y=6.732X-1.587（r=0.9999，n=5）。结果表明，葛根素浓度在2.0～50.0 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

2.5.3精密度实验 取对照品溶液5份，按照"2.1 色谱条件"测定，进样20 μL，考察日内及日间精密度。结果表明，葛根素日内精密度（n=5）为1.26%，日间精密度（n=5）分别为0.83%。

2.5.4回收率实验 称取已知含量的葛根芩连丸100 mg（含葛根素5.6 mg/g），精密加入一定量的葛根素对照品，按"2.3 供试品溶液的制备"操作，平行操作9份，按"2.1 色谱条件"测定，计算回收率，见表1。

2.5.5样品稳定性实验 精密吸取对照品溶液，按"2.1 色谱条件"测定，分别在0、2、4、8、12、24 h进样20 μL，记录峰面积，葛根素RSD均

2.6样品含量测定 取批号为20101101、20110111、20110226样品，按"2.3 供试品溶液的制备"操作制备供试品溶液，按"2.1 色谱条件"测定，计算样品中葛根素的含量，见表2。

3讨论

3.1检测波长 采用紫外可见分光光度计对样品进行扫描，葛根素在212、250、268、312 nm处均有吸收峰，参考文献报道及杂志峰的大小，最后选择250 nm作为检测波长。

3.2样品处理 采用加热回流及超声提取，对样品进行处理，两种方法处理后葛根素含量无明显差异，但加热回流提取时间较长、过程较繁琐，而超声提取时间短、过程简单，故本实验选择超声提取制备样品。同时考察了超声时间（20、40、60 min） 与提取溶剂（20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇）对样品的影响，结果表明，超声40和60 min时葛根素含量较20 min时高，超声40和60 min时无明显差异，因此选择超声时间为40 min；选择40%乙醇为提取溶剂时，葛根素含量最高，故本实验最终确定40%乙醇为溶剂，超声时间40 min。

3.3色谱条件 本实验比较了甲醇-0.1%磷酸和甲醇-水两种流动相，经实验，发现甲醇-0.1%磷酸为流动相，基线噪音较大，且明显下移。本实验采用的甲醇-水（15∶85），基线平稳，样品分离度好，峰形对称，保留时间适宜，无杂质干扰，故最终选择了甲醇-水（15∶85）作为流动相。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：二部[S].2010版.北京：中国医药科技出版社，2010：1146.

[2]程岚，王博，张海燕，等. RP-HPLC法同时测定山葛降脂分散片中葛根素和牡荆素鼠李糖苷的含量[J].中国中医药学刊，2010，28（3）：548-549.

[3]张春霞，周爱珍，尹华.高效液相色谱法测定心血宁片中葛根素的含量[J].中国中医药学刊，2008，26（11）：2515-2517.

[4]栾爽，王冬梅，赵怀清，等.HPLC同时测定心脑联通胶囊中葛根素、虎杖苷和野黄芩苷的含量[J].中国药学杂志，2008，43（19）：1510-1512.编辑/张燕