啤酒废酵母中谷胱甘肽的提取模型及最佳提取条件研究

摘要：指出了我国啤酒年产量已达到5000万t，啤酒废酵母的年产量可达50～75万t。啤酒废酵母主要综合利用方式是将其作为饲料工业的原料，但是啤酒废酵母中含有丰富的氨基酸、维生素、谷胱甘肽和矿物质等有用成分，将其作为饲料工业原料后，这些营养成分的附加值将会严重减少。打破传统的啤酒废酵母利用方式，以成都某啤酒生产厂的啤酒废酵母为原料提取谷胱甘肽，增加啤酒废酵母的经济附加值。以啤酒废酵母为研究原料，利用软件Design-expert6.0中的响应面法分析了热水法提取啤酒废酵母中的谷胱甘肽（glutathione，简称GSH）的提取模型和最佳提取条件。通过响应面法分析得出热水法提取GSH的最佳实验条件为：pH值1.6、温度61.8℃、提取时间11.4min、料水比0.39g/mL。在此提取条件下，GSH的提取量达7.83mg/g，通过实验验证了理论值与实验值的相对误差为0.0008，表明响应面法得出的提取模型和最佳实验条件合理有效。

关键词：啤酒废酵母;谷胱甘肽;响应面法;最佳

中图分类号：TS209

文献标识码：A文章编号：1674-9944（2015）04-0330-07

1引言

啤酒在食品工业中具有一定的战略经济地位，2011年底世界上啤酒的年产量已达到1927亿L，啤酒已成为继茶、碳酸饮料、牛奶和咖啡后的第五大消费饮料[1]。中国是全球啤酒消费量和产量最大的国家，2011年我国啤酒总产量为0.5亿t[2]，同时啤酒产量以每年6%的百分点不断增长。

啤酒废酵母是啤酒生产过程中的主要副产物之一，它是由啤酒和酵母细胞组成的泥浆状混合物，含有丰富有用成分，各种物质的含量如表1所示。

啤酒酵母的有用成分和含量相对食用酵母、面包酵母及精牛肉来说具有较高的营养价值。

随着啤酒产量的逐年增加，啤酒废酵母的产生量也不断增大，其中每生产100t啤酒，就会产生大约1～1.5t的酵母泥[3]，废酵母的含水量在70%～90%之间[4]。2/3的废酵母来源于主发酵沉淀酵母，剩余的废酵母主要是后发酵贮酒罐的沉淀酵母，这些啤酒废酵母的合理化利用将会带来可观的收益，反之将会给环境带来巨大挑战。

目前啤酒废酵母提取制药物质的研究中，有一个重要的研究方向是啤酒废酵母提取谷胱甘肽，谷胱甘肽主要由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成，是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽。谷胱甘肽是一种具有重要生理功能的活性肽，对维持身体正常的免疫系统、抗氧化和整合解毒等发挥重要作用。

本文以啤酒废酵母作为原料，采用热水法提取废酵母中的GSH，同时通过响应面实验设计进行提取条件的优化。

2实验

2.1实验装置

实验装置示意图如图1所示。

2.2实验方法

2.2.1啤酒废酵母预处理方法

实验所用啤酒废酵母取源于成都市某啤酒生产厂，将取得的啤酒酵母混合液分装于离心管内，以2500r/min速度离心20min，去掉上清液，加入5倍体积去离子水，用玻璃棒搅拌均匀，再以2500r/min速度离心20min，重复3次，去掉上清液，用称量袋分装沉淀的湿酵母，置于4℃的冰箱内备用。

2.2.2含水量测定

参照城市污水污泥检验方法（CJ/T221-2005），将均匀的预处理后的啤酒废酵母称量后放入恒重的蒸发皿在水浴上蒸干，然后在105℃的烘箱内烘干至恒重，减少的重量与原重量的百分比值作为含水量，计算公式如下：

ω=m-（m1-m2）m*100%（1）

式中：m为废酵母取样质量，g;m1为烘干恒重后蒸发皿与废酵母的总质量，g;m2为蒸发皿的质量，g。

2.2.3GSH的测定

目前测量谷胱甘肽的方法主要有3种：四氧嘧啶法、亚硝基铁氰化钠法、5，5'二硫代双（2-硝基苯甲酸）法（简称TNB法）。由于四氧嘧啶法灵敏度高（R2可达0.999以上）、准确度高、数据重现性好、显色稳定、能避免半胱氨酸等含巯基化合物的影响，因此本文采用四氧嘧啶法对啤酒废酵母提取液中的GSH进行定量分析。在实验条件下，GSH与四氧嘧啶反应生成物在305nm有最高吸收峰，人们也将该法称为四氧嘧啶305法。

（1）试剂配置。①1mg/mLGSH标准溶液。准确称取0.1gGSH标准品，用去离子水定容至100mL。②0.02mg/L四氧嘧啶溶液。称取0.08g四氧嘧啶试剂，用去离子水定容至25mL。③0.01mol/L甘氨酸溶液。称取0.0752g甘氨酸，用去离子水定容至100mL。④磷酸盐缓冲溶液。分别配置0.2mol/l磷酸二氢钠中和0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，将二者按照10∶1体积混合，既得0.2mol/L、pH值7.5的缓冲溶液。

（2）标准曲线绘制。分别取GSH标准液（1mg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8和1mL于1～6号10mL比色管中，在各比色管中加入0.02（mg/L）四氧嘧啶溶液0.5mL，从1～10号比色管中加入0.5mL0.01mol/L甘氨酸溶液，再加入0.5mL0.2mol/L磷酸缓冲溶液，用去离子水稀释到10mL，稀释混匀后，静置40min，用1cm比色皿以去离子水作为参比，在波长305nm处测量溶液的吸光度。以测得的吸光度A为纵坐标，GSH含量（mg）为横坐标，绘制工作曲线。啤酒废酵母提取液中的GSH的测量按照上述过程进行。

（3）样品提取液中GSH的测定。取适量体积的酵母提取液于10mL比色管中，加入四氧嘧啶溶液、甘氨酸溶液、磷酸缓冲液各0.5mL，用去离子水稀释至刻度，混匀后，静置40min，用1cm比色皿测量吸光度，同时按照上述过程做空白试样。吸光度计算公式如下：

A=abC（2）

式中：A为浓度为C时溶液的吸光度;a为吸光系数，mL/（mg・cm）;b为比色皿厚度，cm;C为溶液中GSH浓度，mg/mL。

公式（2）中，a是与溶质相关的常数。在同一测量条件下，测量溶液中GSH浓度时，ab的乘积为常数，因此吸光度值与溶液中GSH的浓度值成正比，通过配置GSH溶液标准系列，绘制标准曲线，测量样品溶液的吸光度后，可以计算出样品溶液中GSH的浓度。

2.2.4蛋白质的测定

考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后变为青色，同时结合物在595nm处有最大光吸收，同时其光吸收值与蛋白质的含量成正比，因此用该法作为蛋白质定量测定方法。

（1）试剂配置。①1mg/mL牛血清白蛋白标准溶液。称取0.1g牛血清白蛋白，用去离子水定容至100mL。②0.1mg/mL考马斯亮蓝G-250溶液。称取0.1g考马斯亮蓝G-250试剂于250mL烧杯中，加入50mL90%乙醇充分溶解，再加入100mL85%的H2PO4，用去离子水定容至1000mL。

（2）标准曲线绘制。分别取牛血清包蛋白标准溶液：0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mL于1～6号10mL比色管中，分别在比色管中加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，再分别在1～6号比色管中加入去离子水，使比色管中的液体总体积为6mL。以去离子水为参比，用1cm比色皿在波长为595nm处测量吸光度。

（3）提取液中蛋白质的测定。取适量体积的酵母提取液于10mL比色管中，在比色管中加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，同时加入一定体积的去离子水，使比色管中溶液总体积为6mL，做空白试样，以去离子水为参比在波长595nm处测量样品吸光度（A）。样品中蛋白质浓度的计算原理同公式（2）。

2.3试验设计分析方法

2.3.1响应面分析法

响应面分析法（Responsesurfacemethodology，RSM）是实验条件寻优的方法，该法主要采用数学与统计学相结合，考虑多因素（自变量）影响下对实验结果的影响。其原理是通过多个确定性实验，来模拟实验因素与目标函数的极限状态曲面，从而很容易地进行可靠性分析。响应面法针对多变量试验来说具有耗时短，所需费用、试剂及实验材料少等优点，因此用这种方法对实验条件进行优化时效率较高。其中响应面方法有中心组合设计（CentralComposite，包括通用旋转组合设计、二次正交组合设计等）、BOX设计（Box-Behnken设计）、二次饱和D-最优设计（D-optimal设计）、均匀设计、田口设计等。

本文采用通用旋转组合设计进行实验安排，考察n个因素（xi，i=1，2，3，…，n。）的不同水平对啤酒废酵母提取液中谷胱甘肽含量（yi，i=1，2，3，…，n）、蛋白质（zi，i=1，2，3，…，n）含量的影响，由m组实验可得2m组数据（x1，x2，…，xn，y1），（x1，x2，…，xn，z1）;…;（x1，x2，…，xn，ym），（x1，x2，…，xn，zm），在数学分析上用泰勒展开式模型来进行非线性拟合，一般二次的泰勒展开式就能满足收敛，同时生物科学变量间的特点也遵循以下规律[32]：

f（x）≈f（0）+f'（0）1！x+f"（0）2！x2+…（3）

因此可求得考察因素与GSH含量和蛋白质含量的回归方程：=f（x），=f（x）。在热水法提取啤酒废酵母中的谷胱甘肽的时，以pH（x1）、提取温度（x2）、提取时间（x3）、料水比（x4）为自变量、分别以GSH含量（y）和蛋白质含量（z）为因变量拟合二次函数得：

=f（x1，x2，x3，x4）=a1+b1x1+c1x2+d1x3+e1x4+f1x12+g1x22+h1x32+i1x42+j1x1x2+k1x1x3+l1x1x4+m1x2x3+n1x2x4+o1x3x4（4）

=f=f（x1，x2，x3，x4）=a2+b2x1+c2x2+d2x3+e2x4+f2x12+g2x22+h2x32+i2x42+j2x1x2+k2x1x3+l2x1x4+m2x2x3+n2x2x4+o2x3x4（5）

其中如果系数ai、bi、…、0i（i=1、2）经过检验可用，不仅能全面掌握自变量和因变量的关系，而且能求出方程的极值点，即确定了GSH含量最高值和对应的最优条件因素取值。

2.3.2正交试验设计

正交实验设计（orthogonalexperimentaldesign）是利用正交表的形式来安排多因素的不同水平的试验设计。正交试验设计的特点是用部分水平试验组合代替全部水平试验组合，进行试验点的安排，试验数据经过分析挑选最优水平组合（例如最优配方、最优工艺条件）。

3响应面法优化热水法提取啤酒废酵母

中的GSH

3.1啤酒废酵母含水量分析和GSH提取步骤

3.1.1啤酒废酵母含水量分析

本文所用啤酒废酵母来自成都市某啤酒厂，啤酒废酵母形貌如图2所示。

取4个样的含水量的平均值作为啤酒废酵母的含水量，即为90.35%。

3.1.2热水法提取废酵母中GSH的步骤

准确称取预处理的啤酒废酵母于250mL的烧杯中，根据料水比加入相应的去离子水，再用浓硫酸调节至所需的pH值，将烧杯放置在一定温度的恒温水浴锅中，在180r/min的条件下提取一定时间。提取后混合液冷却至室温，转移至离心管中，在2500r/min条件下离心20min，将上清液装入试剂瓶中及时测定提取液中GSH和蛋白质含量。提取完后的固体废物转移至烧杯中，放入60℃的烘箱内烘干至恒重，装入样品袋中，置于干燥皿中备用。

3.1.3标准曲线

（1）GSH标准曲线。采用四氧嘧啶法测定提取液中GSH的含量，标准系列的配置和测量结果如表3所示。

标准曲线见图3所示。

由图3可知标准曲线方程为y=0.003x+0.044，R2=0.998，在测定提取液中的GSH时，取0.5mL样品进行测量，对照标准曲线方程计算提取液中GSH的含量。若样品吸光度测量值超出标准曲线范围，应增加提取液体积或者稀释后再进行测定。

（2）蛋白质标准曲线。采用考马斯亮蓝法测定提取液中的蛋白质，标准系列及结果如表4所示。

蛋白质标准曲线如图4所示。

由图4所示标准曲线方程为y=0.006x-0.045，R2=0.999，在测定提取液中的GSH时，取0.05mL样品进行测量，对照标准曲线方程计算提取液中蛋白质的含量。若样品吸光度测量值超出标准曲线范围，应增加提取液体积或者稀释后再进行测定。

3.2单因素试验

3.2.1pH值对GSH提取的影响

在温度、时间和料水比不变（分别为65℃、5min、0.25g/mL）的条件下，加入浓硫酸调节溶液的pH值，在不同的pH值条件下提取啤酒废酵母中的GSH和蛋白质，结果如图5所示。

由图5可知当pH值为2时，GSH含量最大，随着pH值的不断增加，GSH和蛋白质的提取量不断降低，主要由于浓硫酸的添加量变少，啤酒酵母的细胞破裂数量减少，从而酵母细胞内的GSH、蛋白质没有得到有效释放。同时pH值的增大，提取过程中GSH氧化程度也加大，从而使提取液中GSH含量降低。

3.2.2温度对GSH提取的影响

当pH值、时间和料水比保持不变（分别为2min、5min、0.25g/mL），考察温度分别为40、50、60、70、80、90℃时，提取液中GSH和蛋白质含量的变化情况。实验结果如图6所示。

由图6可知，随着温度的升高，GSH的提取量不段增加，当增加温度升高到60℃时，提取液中GSH的含量最高，同时蛋白质的含量也最高，继续升高提取温度，GSH的含量几乎保持恒定，而蛋白质由于温度的升高而逐渐降低，主要由于温度升高蛋白质将发生变性，从而含量降低。

3.2.3提取时间对GSH提取的影响

保持pH值、温度和料水比不变且分别为2℃、60℃、0.25g/mL，考查在提取时间分别为0、5、10、15、20、30min条件下，GSH、蛋白质提取量的变化，如图7所示。

根据图7得知，随着提取时间增加，GSH的含量在不断增加，蛋白质的含量也不断增加。当提取时间为5min时，GSH的提取量达到最大，增加提取时间GSH的提取量几乎保持不变。

3.2.4料水比对GSH提取的影响

当pH值、温度、时间分别保持为2℃、60℃、5min时，在料水比分别为0.05、0.25、0.45、0.65、0.85、1g/mL条件下，研究啤酒废酵母提取液中GSH、蛋白质含量变化情况，如图8所示。

根据图8知，随着料水比的增加GSH的提取量增加后降低，蛋白质的提取量不断降低。当料水比为0.2g/mL时，GSH的提取量最高。

3.3响应面分析

在单因素实验基础上，确定影响GSH提取因素的取值范围，采用Design-expert6.0软件进行GSH提取优化实验的设计。

3.3.1中心组合设计因素水平

通过单因素实验分析，选取pH值（x1）、提取温度（x2）、提取时间（x3）、料水比（x4）四个因素作为自变量，采用响应面法中的中心组合设计对谷胱甘肽的提取工艺条件进行优化，具体的因素水平确定如表5所示。

3.3.2响应面设计实验结果分析

（1）实验结果。应用designexpert6软件，根据表5实验条件得到实验安排及结果如表6所示。

（2）响应面法分析谷胱甘肽响应面方程及方差分析。通过Designexpert6.0对谷胱甘肽提取效果与各因素进行回归拟合，得到如下方程：

y=-14.415-7.852x1+0.668x2+0.686x3+19.519x4-0.008x22-0.03x32-25.197x42+0.127x1x2（6）

该回归方程中自变量对因变量（影响因素对响应值）的影响的显著性用F检验进行判断，其中p值大小表示显著性的高低，当p<0.01为高度显著（用“**”表示），当p<0.05为显著（用“*”表示），方程的回归分析如表7所示。

表7直观反映了各因素及其交互作用对响应值（GSH提取量）的影响，x1、x2、x3、x4对模型的影响为高度显著，同时x2、x3的二次方对模型的影响也为高度显著，x1、x2的交互对模型的影响也为高度显著。模型项p<0.0001说明响应值与x1…回归的关系是极显著。

（3）响应面法对谷胱甘肽提取液中蛋白质含量的分析。通过Design-expert6.0对GSH提取液中蛋白质的含量的分析得出蛋白质含量的方程模型如下：

z=-32.301+17.971x1+0.535x2+2.136x3+22.252x4-0.102x32-34.371x1x4（7）

对方程（7）进行方差分析，分析结果如表8所示。

根据相应方差分析表中p值的大小，可以看出，啤酒废酵母提取GSH过程中，pH值、提取温度、料水比等对提取液中蛋白质含量的影响显著，pH值与料水比的交互作用对蛋白质的含量也有高度显著影响。同时根据模型值P值大小表明所得方程对蛋白质的提取量高度显著，因此可用此方程来计算一定提取条件下的蛋白质提取含量。

（4）验证性试验。分别对GSH的回归方程的x1、x2、x3、x4求一阶导数，可得如下4个方程：

y'（x1）=-7.852+0.127x2（8）

y'（x2）=0.668-0.014x2+0.127x1（9）

y'（x3）=0.686-0.06x3（10）

y'（x4）=19.519-50.394x4（11）

当倒数为零时，求出的x1、x2、x3、x4对应的y值最大，也即是啤酒废酵母提取GSH的最佳提取条件。因此令方程（8）～（11）为零得：x1=1.6、x2=61.8、x3=11.4、x4=0.39，即GSH提取的最佳工艺条件为：pH值为1.6、温度为61.8℃、提取时间为11.4min、料水比为0.39g/mL。

在此最佳工艺提取条件下，通过三组平行实验，验证该条件的GSH和蛋白质提取结果的可靠性，实验结果如表9所示。

实验验证结果说明，实验值与预测值吻合度高，相对误差小，证明模型计算的值与优化实验的测定值是一致的。同时，所得GSH最优提取条件下，蛋白质的提取量不高，有利于GSH的提纯等后续工艺进行。因此回归方程为啤酒废酵母细胞内的GSH的提取提供了一个较好的模型，可将此模型应用于GSH的提取工艺中。

4小结

（1）分析来自成都某啤酒生产厂的啤酒废酵母的性质，测定啤酒酵母的含水量为90.35%。

（2）利用单因素试验分析pH值、温度、提取时间、料水比对GSH、蛋白质提取量的影响，分析得出：GSH最佳提取条件范围为，pH值1.5～2.5，温度50～70℃，提取时间5～15min，料水比0.2～0.5g/mL。

（3）利用Design-expert6.0中的响应面分析法和GSH的最佳实验条件范围进行实验设计。根据实验结果：从啤酒废酵母中提取GSH的最佳实验条件为pH值为1.6、温度为61.8℃、提取时间为11.4min、料水比为0.39g/mL。根据预测模型计算出啤酒废酵母中活性炭的最佳提取值可达7.829mg/g。

（4）通过实验验证预测模型得出的最佳实验条件的GSH提取量值，最佳提取条件下进行的三组平行试验的平均值为7.823mg/g，表明实际值与预测值大小基本一致，说明所得模型很好地反映了GSH的提取情况，可用于指导实践工作。

参考文献：

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