超高效液相色谱―串联质谱法测定水产品中甜蜜素

摘要 建立了一种采用超声波提取，经正己烷萃取除去油脂有机物，由超高效液相色谱-串联质谱法定量准确、快速检测水产品中甜蜜素的方法。甜蜜素含量在10～100 ng/mL的范围内与峰面积有良好的线性关系，相关系数为0.999 7，检出限为0.01 mg/kg。添加水平分别为0.1、0.2、0.5 mg/kg的样品加标回收率为83.3%～95.6%，测定结果的相对标准偏差均小于5%（n=6）。该方法简便、准确、高效，适用于水产品中甜蜜素测定。

关键词 超高液相色谱-串联质谱法；水产品；甜蜜素

中图分类号 TS207.3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）11-0309-01

甜蜜素（sodium cyclamate），化学名称为环己基氨基磺酸钠，属人工合成的磺胺类无营养型食品添加剂[1]。其口感好、甜度是蔗糖的30～40倍，价格低廉，被广泛应用到甜味食品中。但人工合成甜味剂的安全性从20世纪70年代开始受到质疑，研究发现食用甜蜜素可能有致癌、致畸、损害肾功能等副作用，美国、英国、日本等经济发达国家开始禁止在食品中使用甜蜜素，中国、欧盟等40余个国家、地区对此也分别作出限制[2]。

本研究建立了一种采用超声波提取，经正己烷萃取处去油脂类有机物，由超高效液相色谱-串联质谱法定量准确、快速检测水产品中甜蜜素的方法。其检出限大大降低，结果准确可靠，且样品无需固相萃取过程就可以进样，节约了检测成本，节省了分析时间，提高了分析效率，是控制出口水产品中甜蜜素含量的有效测定方法。为水产品出口企业在加工过程控制甜蜜素添加，满足出口国的甜蜜素的含量要求提供了有力的技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 试验仪器。Agilent 6210A串联三重四级杆质谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；T25 basic高速均质器（德国 IKA实验仪器公司）；Agilent 1290超高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有效公司）；BS2202S电子天平（北京赛多利斯有限公司）；SB-25-12DTS超声波提取器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；L530台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；XK96-A快速混匀器（姜堰市新康医疗器械有限公司）。

1.1.2 试验试剂。乙腈、甲酸均为色谱纯（美国Tedia公司）；甜蜜素标准物质：纯度>99.0%（德国Dr.Ehrenstorfer公司）；试验用水为超纯水。

1.2 标准溶液配制

准确称取0.020 0 g甜蜜素标准物质，用纯水溶解定容至100.0 mL，得到浓度为200 μg/mL的标准储备液；准确移取500 μL标准储备液用纯水稀释定容至100.0 mL，得到浓度为1.0 μg/mL的标准中间液，再逐级稀释成浓度分别为10、20、40、80、100 ng/mL的系列标准工作溶液供HPLC-MS/MS测定。

1.3 样品处理

称取1 g均质处理（转速5 000 r/min）后的糜样（精确至0.01 g），置于50 mL具塞塑料离心管中，加入10 mL纯水，旋涡混匀后，超声提取15 min，于4 000 r/min离心5 min；上清液经定量滤纸过滤后，取1 mL滤液加入3 mL正己烷涡旋萃取，滤液过0.2 μm PTFE滤膜，供UPLC-MS/MS测定。

1.4 色谱与质谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相：0.1%甲酸水溶液-乙腈（体积比70∶30）；流速：0.5 mL/min；进样量：2 μL；柱温：25 ℃。

多反应监测MRM；负离子模式；电喷雾离子源（ESI）；干燥气流速：10 L/min；干燥气温度：350 ℃；毛细管电压：3 500 V；雾化器压力：50 psi；甜蜜素的定性定量离子对、碎裂电压、碰撞能量等参数：母离子为178.1，子离子为80.0，驻留时间为200 ms，碎裂电压为120 V，碰撞能量为25 eV。

2 结果与分析

2.1 前处理过程的优化

检测标准GB/T 5009.97―2003及SN/T 1948―2007中对甜蜜素的样品处理均采用水浸泡或超声直接处理后检测。在初期试验中对水产品采用前2种方法直接处理，得到的添加回收率均极低，故不适合直接应用上述检测方法。分析原因，2个标准中的甜蜜素的检测对象限定在饮料、糕点和凉果等基质，而水产品中蛋白质、脂肪含量高，属于复杂基质，待测甜蜜素易被大分子蛋白吸附损失或被油脂有机分子包裹后在色谱柱中的保留性质被改变，使得最终质谱检测到的甜蜜素极低。经过大量的试验优化，超声仪的使用减少了提取过程中的蛋白吸附，相比水溶液涡旋得到的回收率更高；而正己烷萃取在水产品处理中更为重要，在某些检测样本中经正己烷处理后，得到的回收率由30%提高到95%以上。故最终采用水溶液中超声提取甜蜜素，再经正己烷除去油脂处理后，由液相质谱仪进行检测。且无须过固相萃取过程就可以得到良好的检测基线和较高的回收率，大大节约了检测成本[3-5]。

2.2 色谱条件的优化

由于甜蜜素是极性较强的物质，适合采用反相C18柱分析。本试验是利用超高效液相色谱仪进行样品分离，故选取适合仪器的Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18，3.0 mm×100 mm粒度1.8 μm的色谱柱，可以实现快速分离，在2 min之内就能完成单个样品的检测，大大缩短了检测时间。在本实验中，考察了4种流动相组成体系分别是0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈、0.1%乙酸水溶液-甲醇和0.1%乙酸水溶液-乙腈。试验结果表明，0.1%甲酸水溶液-乙腈（体积比70∶30）的组成能够得到更好的峰形和响应值，因此选择其作为流动相[6-9]。

2.3 质谱条件的优化

由于甜蜜素属于钠盐，在试验检测中，发现正离子模式响应较差，故采用负离子模式检测。首先选择全扫描（SCAN）模式找到甜蜜素的母离子（m/z）178.1，然后用子离子扫描模式得到子离子（m/z）80.0。通过调整干燥气温度、干燥气流速、雾化器压力、碎裂电压和碰撞能量得到较高的灵敏度，确定最佳的质谱参数，检测甜蜜素的MRM参数，得到极性为电负性，母离子（m/z）为178.1，子离子（m/z）为80.0，驻留时间为200 ms，碎裂电压为120 V，碰撞能量为25 eV。

2.4 线性范围和检出限

在10～100 ng/mL质量浓度范围内以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X为横坐标绘制标准工作曲线，得到线性方程为Y=44.084 7X-6.869 6，相关系数r=0.999 7。以信噪比S/N≥3时计算方法的检出限为0.01 mg/kg，方法灵敏度达到限量检测要求。

2.5 方法的回收率和精密度

选用烤鱼片、冻虾仁、罗非鱼肉作为样品，在阴性样品中添加标准溶液的方法进行回收率和精密度测定，分别添加1 μg/mL的标准中间液0.1、0.2、0.5 mL，每个添加浓度平行测定6次，测定结果见表1。样品中甜蜜素的加标平均回收率在83.3%～95.6%之间，相对标准偏差小于5%。说明建立的方法具有可靠的准确度与精密度。

3 结论与讨论

采用超声波提取，超高液相色谱-串联质谱直接测定的方法，在烤鱼片、冻虾仁、罗非鱼肉中回收率在83.3%～95.6%之间且精密度好（相对标准偏差小于5%）。本方法具有快速准确的优点，适合日常大批量样品的检测，能够满足水产品中甜蜜素的定性和定量的要求。

4 参考文献

[1] 明立艳.食品中甜蜜素的检测方法研究[J].农业科技与装备，2012，215（5）：54-55.

[2] 陈炳卿，孙长.食品污染与健康[M].北京：化学工业出版社，2002：360.

[3] 胡贝贞，宋伟华，董文洪.固相萃取-液相色谱/串联质谱法测定黄酒中甜蜜素[J].化学分析计量，2012，21（1）：55-57.

[4] 臧光楼，董明盛.白酒中甜蜜素检测方法的研究[J].食品科学，2009（10）：261-264.

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[6] 朱怀远，庄亚东，熊晓敏，等.离子色谱法直接测定食品添加剂中的甜蜜素[J].食品科学，2012（2）：173-176.

[7] 徐春祥，秦金平.液相色谱-质谱联用直接测定白酒中的甜蜜素[J].食品与发酵工业，2006（2）：106-107.

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[9] 余胜兵，黄伟雄，许瑛华，等.测定饮料中甜蜜素的毛细管柱气相色谱方法研究[J].华南预防医学，2010（4）：67-68.