超声波法提取马鞭草黄酮条件的优化及其抗菌活性研究

摘要：采用超声波法提取马鞭草（Verbena officinalis）中总黄酮，设计单因素试验和正交试验考察超声波功率、乙醇体积分数、超声波处理时间和料液比对总黄酮提取效果的影响，优化提取工艺条件。并采用纸片琼脂扩散法考察马鞭草提取物对几种微生物的抑制作用。结果表明，优化的马鞭草总黄酮提取条件为乙醇体积分数60%、超声波功率350 W、超声波处理时间50 min、料液比m马鞭草∶V乙醇=1∶30（g/mL）。抑菌试验表明，马鞭草黄酮类化合物对大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、白假丝酵母（Candida spp.）、青霉（Penicillium citrimum）、黑曲霉（Aspergillus niger）均有一定的抑制作用。

关键词：超声波法；马鞭草（Verbena officinalis）；黄酮类化合物；抑菌活性

中图分类号：S567.23+9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）03-0645-04

马鞭草（Herba Verbenae）为马鞭草科（Verbenaceae）植物马鞭草（Verbena officinalis）的地上部分，具有活血散瘀、截疟、解毒及利水消肿等功效，主治症瘕积聚、经闭痛经、疟疾、喉痹、痈肿、水肿、热淋等症[1]。近年来对马鞭草活性组分的研究多有报道，其所含化学成分种类较多，主要有环烯醚萜、黄酮、三萜、甾体等[2-5]。黄酮类化合物是广泛存在于植物中的一类重要的化合物，其生物活性多种多样，如对心血管系统的作用、抗肝脏毒性、抗炎及提高机体免疫力、雌激素样作用、抗菌及抗病毒、抗氧化作用等，在食品和医药工业领域应用广泛[6]，因此对马鞭草中黄酮类化合物的研究具有重要意义。传统的黄酮类化合物提取方法主要有醇渗漉法、浸渍法、索氏抽提法和加热回流法等，存在提取时间长、溶剂用量大、提取率低等问题。近年来，超声波提取法因具有设备简单、操作时间短、效率高等优点而得到广泛使用[7，8]。为了更好地开发利用马鞭草，本研究利用超声波法提取其总黄酮，采用单因素试验和正交试验优化提取工艺，并对马鞭草提取产物进行体外抑菌试验，以期为该资源的利用和开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

马鞭草干全草购自保定市中药材公司，经粉碎后过60目滤网，得到预处理的马鞭草粉末。供试微生物菌株由河北大学病原微生物实验室提供，包括大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、白假丝酵母（Candida spp.）、青霉（Penicillium citrimum）、黑曲霉（Aspergillus niger），细菌采用LB培养基培养，酵母及霉菌采用通用真菌培养基YEPD。

主要仪器包括超声波破碎仪、752型紫外可见分光光度计、电子天平、离心机、粉碎机等。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的绘制 参照文献[9]，以芦丁为标准品，测定其不同浓度标准液在507 nm处的吸光度，绘制芦丁标准曲线，以标定提取液中总黄酮含量。

1.2.2 马鞭草总黄酮类化合物的提取 将马鞭草粉末在60 ℃下烘干12 h，精确称量2.00 g，加入50 mL一定浓度的乙醇溶液，置于超声波细胞粉碎仪内进行超声波辅助提取。为避免超声波处理过程中温度升高过快，破坏其中活性产物，超声波处理过程中使用冰浴降温。处理结束后除去固体杂质，收集滤液，滤液经减压蒸馏浓缩后8 000 r/min离心10 min以进一步除去固体杂质，得粗提物，置于100 mL容量瓶中定容，为待测溶液，4 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 单因素试验 设置单因素试验考察超声波功率、乙醇体积分数、超声波处理时间和料液比（m马鞭草∶V乙醇，g/mL）对马鞭草中总黄酮提取率的影响。①超声波功率。准确称取6份马鞭草粉末各2.00 g置于锥形瓶中，加入50.00 mL 体积分数50%的乙醇溶液作为溶剂，设定超声波功率分别为200、250、300、350、400、450 W，超声波提取30 min，提取温度30 ℃，提取液定容到100 mL，测定总黄酮含量。②乙醇体积分数。准确称取6份马鞭草粉末各2.00 g置于锥形瓶中，分别加入50.00 mL体积分数40%、50%、60%、70%、80%、85%的乙醇溶液作为溶剂，设定超声波功率300 W，超声波处理时间30 min，提取温度30 ℃，浸提液定容到100 mL，测定总黄酮含量。③超声波处理时间。准确称取7份马鞭草粉末各2.00 g置于锥形瓶中，加入50.00 mL体积分数50%的乙醇溶液作为溶剂，设定超声波处理时间分别为10、20、30、40、50、60、70 min，超声波功率350 W，提取温度30 ℃，浸提液定容到100 mL，测定总黄酮含量。④料液比。准确称取6份马鞭草粉末各2.00 g置于锥形瓶中，分别加入30.00、40.00、50.00、60.00、70.00、80.00 mL体积分数50%的乙醇溶液作为提取溶剂，设定超声波功率350 W，超声波处理时间30 min，提取温度30 ℃，浸提液定容到100 mL，测定总黄酮含量。

1.2.4 正交试验 在单因素试验的基础上，设置正交试验以进一步优化超声波法提取马鞭草中总黄酮的工艺条件。正交试验因素与水平见表1。

1.2.5 抑菌试验 将灭菌后的专用药敏纸片浸于50 mL浸提液中，浸泡24 h使其充分吸收提取液，以灭菌水为空白对照，采用纸片琼脂扩散法测定抑菌圈直径，以反映供试品的抑菌能力。取液体培养基活化培养好的供试菌0.1 mL，用无菌玻璃刮棒均匀涂布于相应的琼脂培养平板上，用无菌镊子将含有提取液的纸片贴于含菌琼脂平板表面。纸片应贴得均匀，各纸片中心距离不小于24 mm，纸片至平板内边缘距离大于15 mm。将放好滤纸片的含菌培养皿恒温培养，细菌37 ℃培养24 h，真菌28 ℃培养48 h，用游标卡尺测定抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 超声波功率对马鞭草总黄酮提取率的影响 在m马鞭草∶V乙醇=1∶25（g/mL）、乙醇体积分数50%、超声波处理时间30 min时，不同超声波功率对马鞭草总黄酮提取的影响结果见图1。由图1可以看出，试验范围内马鞭草中总黄酮的提取率随超声波功率的增大而逐渐提高，但超声波功率大于350 W后，马鞭草总黄酮的提取率随超声波功率增大而升高的趋势变缓。

2.1.2 乙醇体积分数对马鞭草总黄酮提取率的影响 在m马鞭草∶V乙醇=1∶25（g/mL）、超声波功率350 W、超声波处理时间30 min的条件下，以不同体积分数的乙醇作为提取溶剂，马鞭草总黄酮提取率结果见图2。由图2可知，乙醇体积分数由30%升高到70%，马鞭草总黄酮提取率升高，之后再增加乙醇体积分数，马鞭草中黄酮类化合物的提取率反而有所降低，可能是乙醇体积分数过高会造成植物细胞内一些醇溶性杂质、色素、亲脂性强的成分溶出增加，与黄酮类化合物竞争，从而导致黄酮类化合物提取率下降。

2.1.3 超声波处理时间对马鞭草总黄酮提取的影响 在m马鞭草∶V乙醇=1∶25（g/mL）、乙醇体积分数60%、超声波功率350 W的条件下考察超声波处理时间对总黄酮提取率的影响。由图3可以看出，超声波处理时间由10 min延长到30 min，提取率随处理时间的延长迅速提高；超过30 min时提取率的升高趋势趋于平缓；超声波处理时间长于50 min后总黄酮提取率反而降低。这是因为处理时间较短时细胞内外溶质的浓度差很大，细胞内物质极易释放到提取液中。随着超声波处理时间的延长，马鞭草颗粒中黄酮类化合物相对含量降低。同时由于超声波瞬间产生大量的热和强烈的空化效应，可能对黄酮的结构有一定的破坏作用，所以超声波处理时间不宜过长。

2.1.4 料液比对马鞭草总黄酮提取的影响 在乙醇体积分数60%、超声波功率350 W、超声波处理时间40 min时，考察不同料液比对马鞭草中总黄酮提取率的影响，结果见图4。随着提取溶剂用量的增加，总黄酮提取率有一定提高，说明增大提取液用量有利于马鞭草中黄酮类化合物的溶出。m马鞭草∶V乙醇由1∶15降低到1∶30，提取率快速升高，之后随提取溶剂用量的增加提取率升高的速度变缓。低的料液比有利于提取物的溶出，但是过大的提取剂用量会造成溶剂的浪费，并且不利于后续黄酮类化合物的分离纯化。因此提取剂用量不宜过高或过低。

2.2 正交试验结果

采用正交试验进一步考察乙醇体积分数、超声波功率、超声波处理时间、料液比4个因素对马鞭草总黄酮提取率的影响，结果见表2。由表2可知，各因素对马鞭草中总黄酮的提取率的影响由大到小依次为超声波处理时间、料液比、超声波功率、乙醇体积分数。最佳试验组合为A2B2C3D3，即乙醇体积分数60%、超声波功率350 W、超声波处理时间50 min、m马鞭草∶V乙醇=1∶30（g/mL）。在该试验条件下提取马鞭草总黄酮进行验证试验，重复3次，得到提取液中总黄酮含量为27.53 μg/mL，计算得到总黄酮提取率为1.377%。

2.3 马鞭草粗提物的抑菌试验结果

使用优化得到的方法提取马鞭草中总黄酮，得到浸提液经减压蒸发去除乙醇，采用纸片琼脂扩散法考察马鞭草黄酮类化合物对几种模式微生物（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白假丝酵母、青霉菌、曲霉菌）的抑制特性，抑菌试验结果见表3。试验结果表明马鞭草黄酮类化合物对革兰氏阴性和阳性细菌均具有较强的抑制作用，对潜在致病菌金黄色葡萄球菌和肠道杆菌具有很强的抑制作用，对白假丝酵母也有一定的抑制作用，为马鞭草药物的抗菌临床应用提供了有力证据，并且有助于马鞭草的进一步药物开发应用。

3 小结与讨论

本试验采用超声波法提取马鞭草中总黄酮，在单因素试验的基础上设计正交试验优化提取工艺条件，得到优化的提取乙醇体积浓度为60%、超声波功率350 W、超声波处理时间50 min、m马鞭草∶V乙醇=1∶30（g/mL），得到提取液中总黄酮含量为27.53 μg/mL，总黄酮提取率为1.377%。超声波辅助法提取马鞭草中黄酮类化合物较传统方法具有高效、低能耗、污染小等优点，是一种极具潜力的提取方法。抑菌试验结果发现马鞭草黄酮类化合物具有较强的抗菌作用，对革兰氏阴性和阳性细菌均抑制明显，对马鞭草总黄酮粗提物中各类物质进行抗菌研究具有重要理论意义，值得进一步研究考察。

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