常规HPLC法检验中药常见问题的探讨

[摘要] 目的 探讨常规高效液相色谱（HPLC）法（ODS柱，紫外检测器）检验中药中遇到的常见问题。 方法 结合笔者近几年检验工作的实践和经验来展开分析讨论。 结果 提出了解决常见问题的方法和对策。 结论 具体问题要具体分析，合理调整可变的检验条件是解决问题的重要途径。

[关键词] 中药；HPLC；药品检验

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] C [文章编号] 1673-7210（2012）08（c）-0152-02

Discussion on common problems in traditional Chinese medicine inspection with conventional HPLC method

LI Jinping

Institute for Food and Drug Control in Panzhihua City, Sichuan Province, Panzhihua 617000, China

[Abstract] Objective To discusse the common problems encountered during traditional Chinese medicine inspection with conventional High Performance Liquid Chromatography method(ODS column, ultraviolet detector). Methods These problems were analyzed with years of practices and experiences of the author in drug inspection. Results Methods and countermeasures were put forward to dissolve these common problems. Conclusion With the problems tackled case-by-case, reasonable adjustment of variable inspection conditions is an important way for problem solving.

[Key words] Traditional Chinese medicine; HPLC; Drug inspection

高效液相色谱（HPLC）法是一种同时具有分离、分析功能和快速、高效、灵敏等优点的检测技术，现已成为药品分离、鉴定和含量测定的首选方法[1]。运用HPLC法进行中药检验时，最常规的检测条件是十八烷基硅烷键合硅胶（ODS）为填充剂的色谱柱和紫外检测器[2]。在《中国药典》一部中，很多品种也都采用了常规HPLC法来检验。笔者就自己在运用该法检验中药时遇到的几个常见问题，结合工作实践，谈谈自己的看法，希望能对中药检验工作者，特别是接触检验工作不久的人员提供参考和帮助，以便在遇到类似问题时，容易找到解决的思路和方向，使问题能及时准确地处理，也为检验工作的顺利推进起到积极作用。

1 对照品峰被分成2个的问题

常规HPLC法检验中药中，单一的对照品应该只出1个峰，但有时会出现对照品峰被分成2个的情况，如果遇到这样的问题，笔者认为，不要急于更换色谱柱或调整流动相，可以先考虑减少进样量再进1针，有可能是样量过载。比如笔者在做刺五加片[3]489（多多药业有限公司，批号：1005091）的含量测定时，设定的检验条件：Kromasil 100-5 C18柱，柱温35℃，流动相各组分比例与标准相同，流速0.95 mL/min，进样10 μL，对照品紫丁香苷峰被分成2个，小峰在左侧。在其他条件不变的情况下，将进样量改进5 μL，则峰型正常；在做九味羌活颗粒[4]449（九寨沟天然药业集团有限责任公司，批号：110302）的含量测定时，设定检验条件Kromasil 100-5 C18柱，柱温35℃，流动相各组分比例与标准相同，流速1.00 mL/min，进样20 μL，对照品黄芩苷峰被分成2个，小峰在左侧，同样只将进样量改为10 μL，则峰型正常。如果减少进样量仍不能解决，再考虑更换其他品牌的色谱柱，如果没有多余色谱柱，则可试做其他品种，观察其他对照品是否出现类似情况。笔者多年的实践发现，色谱柱使用多年后或损坏时，会将对照品峰分成2个，小峰多在右侧。这时可以采取有把握的反冲色谱柱或不同极性有机溶剂长时缓冲色谱柱，尽可能使色谱柱再生。

2 理论板数不能满足要求

在《中国药典》2010年版一部中，理论板数是色谱系统适应性的重要指标，明确规定了其下限。检验时有时候会出现理论板数低于下限值。这时先观察理论板数的实际值与规定最小值相差多少，如果不是太大，可通过减少进样量来有效提高理论板数，减少进样量也就减小了半峰宽，根据理论板数的计算公式知当保留时间不变的情况下，半峰宽减小，理论板数增大。如果相差较大，减少进样量也不能满足要求，再考虑更换色谱柱、调整流动相、柱温。

3 分离度不能满足要求

在《中国药典》2010年版一部中，分离度也是色谱系统适应性的一个指标，检验时有时会出现两个物质不能有效分离，如果遇这种情况，笔者认为可以考虑更换色谱柱，这样既简捷也比较有效。不同品牌、规格的色谱柱有各自的特点，对同一物质的洗脱分离能力各不相同。比如笔者在做生脉注射液[5]（四川省宜宾五粮液集团宜宾制药有限责任公司，批号：10082011）的含量测定时，设定的检验条件：菲罗门Luna柱，柱温35℃，流动相各组分比例与标准相同，流速1.60 mL/min，进样20 μL；人参皂苷Rg1与人参皂苷Re不能有效分离。将检验条件改为菲罗门Gemini柱，柱温40℃，其他条件不变，则分离度达到要求。或者将检验条件改为Kromasil 100-5 C18柱，其他条件不变，则分离度也能达到要求。如果没有多余的色谱柱，可以多次调整流动相的比例，通过改变流动相的极性，使被测物质峰的分离度达到要求。

通常情况下，进针都是先进对照品再进供试品，但由于有时会出现供试品中被测物质峰与杂质峰分离度不能满足要求，而使前面对照品进针不能使用的情况，所以对于第一次做的品种，检验开始最好先进一针对照品再进一针供试品，以确定检验条件二者都能满足后，再按常规完成进针。

4 供试品中被测物质峰面积突然增大或峰型异常

在检验过程，有时供试品中被测物质峰会突然出现峰面积增大，或峰型异常。比如笔者在做通窍鼻炎片[4]1057-1058（中山市中智制药有限公司，批号：20091236）、羚羊感冒片[3]608（黑龙江天宏药业有限公司，批号：20080201）、抗感颗粒[3]471（四川好医生攀西药业有限责任公司，批号：080807）的含量测定时，就出现过这种情况。笔者多次实验后发现，这种情况主要是由于供试品中杂质峰干扰导致，供试品的前几针多不会出现这种情况，一般在第5、6针时开始出现，是由于前面供试品中一些在该波长下有吸收的杂质一针一针的逐渐从色谱柱中洗脱下来，碰巧出现在被测物质出峰的时间段内，与被测物质峰完全重叠，则峰面积增大，不完全重叠则影响被测物质峰型而出现峰型异常。遇到这种情况，笔者认为要认真分析前面的色谱图，找出杂质峰出峰的规律，找到合适的时间进针，避开杂质峰就可以了。当然也可以等待，不再进针，让干扰杂质全部流出后再进针。比如笔者在做复方黄连素片[4]923（成都森科制药有限公司，国药准字Z51021798）中芍药苷的含量测定时，按常规操作供试品通常在进第5或6针时，出现强吸收且乱的杂质峰（多个厂家生产的该品种都出现类似的情况）。由于杂质峰干扰严重，很难有效避开杂质峰，多进一针很可能会增加更多等待时间。其次想让杂质峰出的更快些，如果用甲醇、乙腈冲柱，一定要用5%～10%甲醇过渡，因为流动相中含磷酸二氢钾，防止盐析出而导致仪器故障，当然来回平衡流动相也很费时间。

5 其他问题

检验中，有时会出现被测物质的保留时间较长。这时，笔者认为可以考虑在满足被测物质分离度的条件下缩短被测物质的保留时间，加快检验的完成，节约时间，减少人力、物力的消耗。缩短被测物质的保留时间最常见的方法就是调整流动相各组分比例、升高柱温、增加流速，其中以调整流动相组分比例的效果最为显著。由于药典中使用的色谱柱多要求为以ODS为填充剂，属于反相色谱柱，所以合理增加流动相中甲醇或乙腈的比例，一般都能缩短被测物质的保留时间。比如笔者在做复方丹参片[3]527（深圳同安药业有限公司，批号：080702）中丹参酮ⅡA的含量测定时，用菲罗门Luna柱，流动相组分比例由标准中的比例调整为甲醇-水（75∶25）；做生脉注射液[5]（四川省宜宾五粮液集团宜宾制药有限责任公司，批号：10082023）含量测定时，用菲罗门Gemini柱，流动相各组分比例由标准中的比例调整为乙腈-0.05%磷酸溶液（21∶81）；通过调整，它们都能缩短被测物质的保留时间，且满足药典要求。

有时还会遇到被测物质出峰时基线较高，色谱图质量不佳的情况，这时，笔者认为可以考虑减小进样量来优化检验工作。比如笔者在做生脉注射液[5]（四川省宜宾五粮液集团宜宾制药有限责任公司，批号：10082011）含量测定时，设定检验条件：Kromasil 100-5 C18柱，柱温30℃，流动相各组分比例与标准同。按标准操作供试品浓缩5倍，进样20 μL，浓缩后的供试品颜色深，这时色谱图上显示人参皂苷Rg1、人参皂苷Re出峰时，峰起点被抬至23 mV左右。如果将进样量调整为5 μL，则出峰时基线略抬高，峰面积波动更小，色谱图质量提高了，相对标准偏差也更容易满足要求。

6 小结

《中国药典》2010年版规定：各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变[4]附录36。合理调整这些可变的检验条件是解决问题的重要途径。如何准确设定检验条件，除了在检验工作中不断积累经验外，查阅药典、期刊杂志、专业书籍也非常重要，这样不但可以了解同一被测物质还有那些不同检测条件，丰富检验知识，更为检验条件设定提供参考和借鉴。

[参考文献]

[1] 凌志甫，陈博，庞裕玉，等.高效液相色谱法在药品“打假”中的应用[J].中国医药导报，2009，6（7）：131-132.

[2] 刘月娥，黄安军.基层实验室高效液相色谱仪的常见问题与对策[J].西北药学杂志，2010，25（4）：310-312.

[3] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：化学工业出版社，2005.

[4] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010.

[5] 国家药典委员会.中国卫生部药品标准（WS3-B-2865-98）[S].北京：人民卫生出版社，2011：51.

（收稿日期：2012-03-31 本文编辑：卫 轲）