大蒜提取物对结核分枝杆菌基因表达变化的影响

钟英英a，叶 云a，李乃雄b，谭江志a

（广西工学院，a.生物与化学工程学院；b.理学院，广西 柳州 545006）

摘要：通过归一化对芯片数据进行质量控制，采用两样本非配对t检验，比较了2、5和10 μg/mL的大蒜（Allium sativum L.）提取物处理结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）后对其基因表达变化的影响。结果表明，5和10 μg/mL的大蒜提取物处理后获得共同差异基因17个，与氧化应激、蛋白损伤等生物学功能相关。大蒜提取物可能通过上述基因的调控起到抑制结核分枝杆菌的作用。

关键词：大蒜（Allium sativum L.）提取物；结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）；基因芯片；氧化应激

中图分类号：S633.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）20-5054-03

Effect of Garlic Extract on Gene Expression in Mycobacterium tuberculosis

ZHONG Ying-yinga，YE Yuna，LI Nai-xiongb，TAN Jiang-zhia

（a.School of Biological and Chemical Engineering；b.College of Science， Guangxi University of Technology， Liuzhou 545006， Guangxi，China）

Abstract： To investigate the effect of garlic（Allium sativum L.） extract on changes of gene expression in Mycobacterium tuberculosis， gene profile was analyzed. Quality of microarray data was controlled by normalization. The difference between treated with garlic extract and control in Mycobacterium tuberculosis was compared by two sample non-paired t-test. The results showed that 17 differential genes were overlapped in the treatment with 5 and 10 μg/mL garlic extract. These genes are related with oxidative stress and protein damage. Therefore， garlic extract may inhibit the Mycobacterium tuberculosis by regulating the expression of these differential genes.

Key words： garlic（Allium sativum L.）extract； Mycobacterium tuberculosis； gene chips； oxidative stress

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis），俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌。尽管国际上针对结核分枝杆菌已开发出近20种药物，但其副作用大，尤其对肝肾的毒副作用较大，易产生耐药性。近年来耐药及多重耐药菌株（Multiple drugs resistant-bacilus tuberculosis，MDR-TB）的出现，更是对现有的抗结核药物提出了严重挑战。因此，从天然药物中寻找安全有效的抗结核药物，具有重要的意义[1，2]。

大蒜（Allium sativum L.）提取物具有广谱的抗菌活性，对常见的细菌均有较好的抗菌作用。研究表明大蒜素对结核分枝杆菌具有很强的杀菌和抑菌作用[3，4]，而且大蒜素为常用的调味剂，无明显的毒副作用。因此对那些肝功能异常，多种抗结核药物不能使用及耐药性的结核病人，大蒜素不失为一个较好的选择[5]。然而目前大蒜素作用于结核分枝杆菌的研究大多还停留在抑菌效果的观察方面，对其抑菌的分子机理仍然不够清楚，结合基因芯片技术对大蒜提取物处理结核分枝杆菌的基因组进行分析，探讨其作用的分子机制，有利于从天然产物资源中寻找并开发有效的抗结核药物。本研究通过归一化对芯片数据进行质量控制，采用两样本非配对t检验，比较了2、5和10 μg/mL的大蒜提取物处理后对结核分枝杆菌的基因表达变化。

1 材料与方法

1.1 芯片数据

基因芯片数据GSE17640来源于GEO（Gene expression omnibus）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）公共数据库，是4个双通道芯片样本[6]，芯片平台为非商业化的GPL9036（SMD Print_1651 Mycobacterium tuberculosis）。

1.2 芯片制作

结核分枝杆菌H37Rv （ATCC 27294）在37 ℃下用米德尔7H9培养基（包含0.2%甘油、0.5%BSA fraction V、0.05%吐温-80、0.08%NaCl和0.2%葡萄糖）培养至OD650 nm等于0.3（2～3 h）时，用2、5和10 μg/mL的大蒜提取物处理6 h后提取RNA，对照组则用等量的二甲基亚砜处理6 h后提取RNA，经反转录后分别合成标记cDNA制作芯片。

1.3 数据预处理及统计学分析

从GEO数据库中下载芯片数据的原始文件GSM440246、GSM440247、GSM440248、GSM440249分别解压缩之后，去除每组数据表头的注释信息，仅留有基因名称（Gene ID）和表达值（MEAN），即CH1I_MEAN，CH2I_MEAN，并将其分别对应于对照和处理，制成一个样本表达值的文本文档。

使用统计学软件进行芯片数据统计学处理。首先采用justvsn方法进行归一化处理，通过生成箱式图检验归一化效果。然后，将表达值数据进行以2为底的对数转换，用SAM（Significance analysis of microarrays）方法进行两样本非配对t检验，用以筛选经大蒜提取物处理组和对照组的结核分枝杆菌差异基因，排列组合（permutation）次数设为1 000次，P值设定为0.05，假阳性发现率（FDR）小于0.01。通过NCBI数据库对获得的差异基因进行注释，同时对差异基因本体（Gene ontology，GO）实施分析，以找到这些基因对应的生物学功能。

2 结果与分析

2.1 数据处理的质量控制

芯片数据归一化结果的箱式图如图1所示。纵轴是数据值，横轴是芯片数据集中的样本名称，共8个样本。每一个样本用一个方框表示，框中间的横线表示数据的中位值。经过归一化后样本数据的中位值基本相等，有效地消除或降低了样本和芯片造成的系统偏差，从而有利于发现更有意义的生物学信息。

2.2 差异基因的获得

将结核分枝杆菌芯片样本分为两组：对照组和大蒜提取物处理组。5、10 μg/mL大蒜提取物处理组获得倍数变化为2倍以上的基因分别为56个和101个，将这些差异基因进行交集共获得17个共同的差异表达基因，有部分为功能未知基因，功能已知的有trxB2、trxC、clpB、sigH、dnaJ、dnaK、Hsp、Rv0331、Rv3463、Rv3054c、Rv1334和Rv1335等，这12个基因经大蒜提取物处理后在结核分枝杆菌中表达上调，而deoD、sigB、ptpA、Rv2111c和esxA等5个基因则表达下调。

2.3 差异基因的功能注释

通过NCBI数据库对上述差异表达基因进行注释，发现上调基因主要与热激反应、氧化应激、蛋白损伤等生物学功能相关。其中，trxB2、trxC与硫氧还蛋白系统的组分有关，即受蛋白质损伤的影响较大；而Rv0331、Rv3463、Rv3054c、Rv1334、Rv1335、clpB、 sigH、dnaJ、dnaK和hsp与热激反应有关。下调基因中Rv2111c和esxA功能未知，deoD、sigB则与DNA复制、转录有关。

差异基因的GO分析表明，上调基因主要参与了生物过程中的化学刺激的细胞反应、细胞氧化应激反应和活性氧物种反应等。如clpB、Rv346、dnaK和Hsp是细胞中膜和质膜等结构的主要组分，dnaK和Hsp应对在生物过程中各类应激反应。

3 小结与讨论

由于基因芯片技术只是一种半定量的分析手段，存在一定的误差。因此，基因芯片数据的准确性直接影响到后期的分析，因此如何获得高质量的基因芯片数据是关键环节[7]。基于上述原因，在数据处理的前期先经过芯片数据归一化等质量控制的手段，尽可能消除由于数据偏差带来的试验误差，获得更为准确的分析结果。

大蒜是一种药食两用的食品，大蒜提取物的主要成分为大蒜素。体外抑菌试验结果表明，高浓度大蒜素对结核分枝杆菌具有很强的杀菌和抑菌作用，机制可能是大蒜素分子中的氧原子与细菌生长繁殖所必须的半胱氨酸分子中的巯基结合，能抑制结核分枝杆菌蛋白质的合成，同时抑制细菌旋转酶而使DNA复制受阻、降解而致结核分枝杆菌死亡[8]。本研究通过基因芯片的表达谱分析，发现低浓度的大蒜提取物处理对结核分枝杆菌也有影响，会导致部分热激反应、氧化应激反应以及蛋白损伤相关的基因表达上调，而一些与转录及翻译相关的基因则表达下调，表明DNA复制和蛋白质合成等生物学活动受到了一定的抑制。

氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。氧化应激起源于反应性的氧化物与生物抗氧化剂间平衡的破坏，造成活性氧浓度升高，过多的自由基会引起毒性作用。因此，氧化应激相关基因表达上调可能导致结核分枝杆菌生物膜脂质过氧化，细胞内蛋白及酶变性，核酸和染色体被破坏，导致细胞死亡[9]。有研究表明，在细菌衰老过程中，转录错误或翻译错误会导致部分异常多肽的轻微错误折叠，导致蛋白质疏水表面的增加，从而使得DnaK/DnaJ的伴侣蛋白系统的作用位点增加，进一步增加蛋白质氧化作用的敏感性和蛋白质错误折叠[10]。在分析基因芯片数据的过程中，也发现trxB2、trxC、dnaJ和dnaK等与蛋白损伤相关基因表达上调，其中dnaJ和dnaK表达上调这可能是由于结核分枝杆菌经过大蒜提取物处理后受到自由基的攻击，导致蛋白损伤，从而降低或失去原有蛋白质的功能，加速细胞衰老。另外，经过大蒜油的处理也会使得结核分枝杆菌的Rv0331，Rv3463，Rv3054c，Rv1334和Rv1335等基因表达上调，诱导结核分枝杆菌产生热激蛋白（Heat shock protein，HSP）并在其体内迅速积累，导致相关蛋白折叠、正常的蛋白合成受到抑制、细胞内分配及降解；还会对胞内酶造成破坏，细胞正常的代谢受阻，导致生长发育终止或者引起细胞死亡[11]。

参考文献：

[1] 陈伟光.中药及有效成分抗结核的研究进展[J].时珍国医国药，2005，16（10）：998-999.

[2] 崔新颖，孔祥雨. 抗结核药物及其应用研究[J].北华大学学报（自然科学版），2009，10（3）：246-250.

[3] RUDDOCK P S， LIAO M， FOSTER B C， et al. Garlic natural health products exhibit variable constituent levels and antimicrobial activity against Neisseria gonorrhoeae， Staphylococcus aureus and Enterococcus faecalis[J]. Phytother Res， 2005， 19（4）：327-334.

[4] 李 静，吴卫东.大蒜、生姜水浸液对体外细菌抑制的对比研究[J].中国调味品，2008，33 （12）：27-39.

[5] 刘金伟，王金河，仲 斌，等.大蒜素对结核分枝杆菌体外抑菌效果观察[J].人民军医，2001，44（4）：236-237.

[6] O'DONNELL G， POESCHL R， ZIMHONY O， et al. Bioactive pyridine-N-oxide disulfides from Allium stipitatum[J]. J Nat Prod，2009，72（3）：360-365.

[7] MARSHALL A， HODGSON J. DNA chips：An array of possibilities[J]. Nature Biotechnology，1998，1（1）：27-32.

[8] 徐林霞，明 亮.中草药抗结核分枝杆菌的实验研究[J].长治医学院学报，2007，21（3）：169-171.

[9] 毛晓明，刘志民.氧化应激在糖尿病糖代谢中的作用[J].江苏医药，2005，31（3）：212-213.

[10] FREDRIKSSON A，BALLESTEROS M，DUKAN S，et al.Defense against protein carbonylation by DnaK/DnaJ and proteases of the heat shock regulon[J]. J Bacteriol，2005，187（12）：4207-4213.

[11] 杨 玲，黄锦佳，葛 红. 热激处理在抑制植物组织褐变中的应用[J]. 热带农业科学，2007，27（3）：10-16.