儿童贫血基因谱分析

α 地中海贫血( α-thalassemia，简称 α 地贫) 是由于 α-珠蛋白基因缺失或功能缺陷( 点突变) 而导致 α-珠蛋白链合成障碍的一种常染色体不完全显性遗传性疾病。我国南方是 α 地贫的高发区，研究资料表明广东地区 α 地贫的检出率为 8． 3%［1-2］，已成为当今严重的公共卫生问题。本研究对我院确诊的 471 例儿童 α 地贫患儿基因缺失类型进行分析，探讨 α 地贫缺失型基因的分布特征，为确诊儿童将来的遗传咨询和婚育指导提供依据。

1 资料与方法

1． 1 研究对象

2009 年 1 月至 2011 年 7 月在佛山市妇幼保健院儿科门诊和儿童保健科就诊、体检的儿童中，将血细胞分析检测平均红细胞体积( MCV) ＜ 82 fl 者纳入本研究。

1． 2 仪器和试剂

Sysmex XT-2000i 全自动血细胞分析仪由日本希森美康公司生产，XT-2000i 所用测定试剂由该公司提供。PCR 扩增仪为美国 BioRad 公司生产的icycler 扩增仪( 或美国 ABI 公司生产的 2720 扩增仪) ，DNA 抽提试剂盒、α 地贫 gap-PCR 基因诊断试剂盒由深圳亚能生物技术有限公司提供。

1． 3 方法

1 ． 3 ． 1 MCV 的测定 使用 Sysmex XT-2000 i全自动血细胞分析仪对全部受检儿童进行血细胞分析。

1． 3． 2 α 地贫基因分析 对经血细胞分析 MCV＜ 82 fl 者用无菌 EDTA 抗凝管抽取静脉血 2 mL，采用以缺 口 PCR( gap-PCR) 为 原 理 的 单 管 多 重PCR( multiplex PCR，M-PCR) 进行缺失型 α 地贫基因检测。( 1) PCR 扩增: 用全血( EDTA 抗凝) DNA 快速提取试剂盒按操作说明提取 DNA。单管 PCR 反应混合液为 21 μL ( 已含有 7 种引物、反应用酶1． 0 μL) ，加入待测样本 DNA 4． 0 μL，总反应体系为 25 μL。按以下条件循环: 96℃预变性 15 min; 然后 98℃变性 45 s，64℃退火 90 s，72℃ 延伸 3 min，共 35 个循环; 最后 72℃延伸 5 min。( 2) 电泳: 用 0． 5 × TBE 缓冲液配制 0． 8% 琼脂糖凝胶，以 Gold view 为染色剂，取 3 μL 扩增产物加于水平电泳仪上，恒压 5 V/cm，电泳约 1． 0 h，在紫外凝胶透射成像仪上观察。每次反应均设阳性对照、阴性对照、空白对照和 Marker。

1． 4 统计学分析

采用 SPSS 13． 0 统计软件包进行数据处理。计数资料采用率( %) 表示，不同性别 α 地贫检出率比较采用 χ2检验，不同年龄组 α 地贫检出率比较采用趋势 χ2检验。P ＜0． 05 为差异有统计学意义。

2 结果

2． 1 α 地贫检出率

血细胞分析示 MCV ＜82 fl 者 1341 例，其中男896 例，女 445 例，年龄为 0 ～ 14 岁。经 α 地贫基因检测，确诊 α 地贫患儿 471 例( 35． 1%) ，其中男302 例，女 169 例。不同性别患儿 α 地贫检出率差异无统计学意义( χ2= 2． 382，P = 0． 129) ; 不同年龄患儿 α 地贫检出率差异有统计学意义( χ2= 24． 88，P ＜ 0． 01 ) ，随着年龄的增长，α 地贫检出率增加。见表 1，表 2。

2． 2 α 地贫基因型和基因频率

本反应体系可扩增出长度约为 1． 8 kbp、2 kbp、1． 6 kbp 和 1． 3 kbp 的 4 个条带，分别代表人类α-珠蛋白基因( 即正常人) 、3． 7 缺失型、4． 2 缺失型、SEA 缺失型的扩增产物。阴性对照管无扩增产物，阳性对照管出现长度约为 1． 3 kbp 和 1． 8 kbp的 2 个条带，分别为 --SEA缺失型和正常 α 珠蛋白基因扩增的产物。本组资料以 --SEA基因型最常见，占75． 3% ; 并以 --SEA/ аа 基因型多见，占 73 ． 2 % ，其次为 аа/-а3． 7基因型( 12． 5% ) 和 --SEA/ -а3． 7基因型( 5． 5% ) 。见表 3 ～ 4。

3 讨论

α 地贫是一组常染色体单基因遗传性疾病，具有高度的遗传异质性和明显的地理分布特征，且发病率高，严重威胁儿童健康和影响我国人口素质。

不同程度 α 珠蛋白基因缺失导致不同的临床表型，并主要取决于 α 基因缺失的数目［3］。本研究对1341 例血常规 MCV ＜ 82 fl 儿童进行 α 地贫基因检测，阳性结果 471 例，检出率为 35． 1%，明显高于文献报道［2，4-5］，主要与本研究对就诊和体检儿童先进行血常规 MCV 初筛，MCV ＜82 fl 者才进行 α 地贫基因检测有关。本资料显示 α 地贫儿童男、女发病率差异无统计学意义，说明 α 地贫的发病与性别无关。作为常染色体遗传性疾病，α 地贫的发病并无年龄差异，但本组资料通过对 MCV ＜82 fl 者进行基因分析发现，随着年龄的增长，α 地贫的检出率增加，提示随着年龄增长，MCV 降低与地贫的一致性越高。婴幼儿 MCV 值降低除受地贫影响外，亦受缺铁性贫血的影响，婴幼儿是缺铁性贫血的高发年龄，而年长儿缺铁的发生率则明显下降，其 MCV 值受缺铁因素的影响亦明显降低。因此，MCV ＜82 fl 作为年长儿地贫的预测指标较婴幼儿更可靠。但是，儿童时期各年龄段 MCV 值具有动态变化，新生儿红细胞体积较儿童及成人大，出生时 MCV 值可大于94 fl，随 后 逐 渐 下 降，约 至 生 后 6 个 月 时 降 至70 ～ 84 fl，随后 MCV 的正常值逐渐上升，青春期达成人水平。考虑到 MCV 值作为血液学指标具有以上变化，必定会对 α 地贫检出率产生一定影响，因此以 MCV 值异常来预测地贫诊断，还需结合年龄因素进行综合分析。本研究未能根据 MCV 值的动态变化进行年龄分组研究，这是本研究的不足之处。

引起 α 地贫的基因异常有两种类型，即缺失型和非缺失型( 点突变) ，各地缺失型与非缺失型比例不同，缺失型约从 40% 到 70% 不等。在我国南方，引起 α 地贫的分子基础主要是 α-珠蛋白基因簇3 种缺失: ①右侧缺失型( -а3． 7) : 缺失一个3． 7 kb 的基因片段; ②左侧缺失型( -а4． 2) : 缺失一个 4． 2 kb的基因片段; ③东南亚缺失型( --SEA) : 同一染色体上2 个 α-珠蛋白基因全部缺失。-а3． 7缺失型和 -а4． 2缺失型统称为 α+地贫，--SEA缺失型称为 α0地贫。-а3． 7缺失型是全球分布最广、频率最高的基因型，而我国南方则以 --SEA基因型最常见。本研究对 MCV 值降低儿童进行上述常见的 3 种缺失型基因分析，检出471 例 α 地贫患儿中，以东南亚缺失型占主导地位，占 75． 3%，约是 -а3． 7和 -а4． 2两基因总和的 3 倍; α+地贫中以右侧缺失型( -а3． 7) 占优势，是左侧缺失型( -а4． 2) 的 2． 2 倍，与黄钰君等［6］报道结果相似。本研究显示儿童 α 地贫基因型以标准型最为常见，占73． 4% ，并以 --SEA/ аа 为主，占总数的 73． 2% ，与广州和珠海等地相似［5，7］，明显高于昆明地区［8］，说明α 地贫基因型分布具有明显的地理差异。HbH 病占 9． 3%，静止型占 17． 1%，两者基因型构成比均以右侧缺失型占多数，与基因频率的分布一致。本研究未能进行非缺失型检测是本研究的另一不足之处，在今后的临床研究中将进一步完善这方面的工作。

综上所述，本研究 471 例 α 地贫患儿基因缺失以东南亚缺失型占主导地位，基因型以标准型中的--SEA/ аа 多见。 本地区儿 童 出 生 缺 陷 性 疾 病 中α 地贫基因名列第 5 位［9］，是高发的地方性遗传病，因此有必要对 MCV ＜82 fl 的儿童人群常规进行基因诊断，并建议建立 α 地贫基因网络档案库，为计生部门采取有效措施防止重型地贫患儿的出生提供参考依据。