X连锁凋亡抑制蛋白与肝细胞肝癌的研究进展

X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP，又称human IAP-like protein，hILP）是凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）中的其中一个重要成员。IAPs首先在杆状病毒中发现，能抑制感染病毒的宿主细胞凋亡，随后逐渐发现在人类及其他物种中广泛存在。XIAP与杆状病毒IAPs有高度同源性，均具有显著的抗凋亡作用。

1 XIAP的结构特点

人类XIAP基因定位于Xq25，首先由Duckett克隆其全长cDNA，含2540bp。XIAP由497个氨基酸组成，分子量为57KD，N端有3个IAP重复序列BIR1、BIR2和BIR3，与抑制细胞凋亡相关，C端有RING锌指样结构域，具有泛素连接酶E3活性，可自身泛素化及泛素化其他底物，从而也调节细胞的凋亡[1]。另外，在XIAP的BIR和RING之间，存在一个泛素结合区域（UBA），与NF-κB的激活有关[2]。

2 XIAP的抗凋亡作用主要途径

2.1抑制caspase caspase是细胞凋亡的执行者。正常情况下以无活性酶原形成存在，在凋亡信号传递下发生瀑布式激活，最终导致细胞凋亡。Deveraux[3]发现，XIAP可直接抑制caspase3、7的活性，而caspase3位于caspase凋亡通路的下游，为caspase凋亡通路中的效应蛋白，为凋亡的执行者。XIAP通过N端的BIR2与caspase3、7的活性部位结合，阻止caspase3、7与底物的结合和进一步级联催化反应[4]。Shiozaki指出，XIAP的BIR3结构域与caspase9单体结合形成异源二聚体，使caspase9保持单体结构，失去催化活性，不能启动caspase级联反应。caspase9位于caspase凋亡途径的上游[5]。因而XIAP可同时作用于caspase的起始阶段及效应阶段。另外，XIAP的C端RING环，可以通过泛素化导致caspase的降解，同样达到抑制caspase途径的凋亡。

2.2 JNK1信号通路 JNK1是丝裂原活化蛋白激酶MAPK重要通路之一，是XIAP另外一条主要抗凋亡途径。XIAP抗凋亡机理中，JNK1信号通路在不同细胞中的作用尚有争论。在IL-1β转换酶诱发的凋亡过程中，XIAP选择性激活JNK，从而达到抑制凋亡的作用[6]。XIAP的过表达激活JNK1信号通路，也可阻止TNF-α，ICE、FAS-诱导的293、MCF7细胞凋亡[7]。ILPIP（人类ILP交互作用蛋白）可以增强XIAP对JNK1的激活，抑制由TNF-α介导的凋亡[8]。而Kaur对鼠肝细胞的研究中发现，XIAP促进泛素化降解TAK1（transformin growth facter-β-activated kinase），阻断JNK1信号通路，从而抑制由TGF-β1介导的细胞凋亡[9]。

2.3通过NF-κB途径 NF-κB是一种重要转录调节因子。NF-κB信号转导通路与肿瘤的发生、增殖、分化、抗凋亡、侵袭和转移有密切关系。肝细胞癌变过程中NF-κB信号转导途径激活和Bcl-2呈过表达状态与肝癌的发生、发展密切相关[10]。NF-κB能上调一些凋亡抑制蛋白的表达，如XIAP，从而防止细胞凋亡。反过来，XIAP及XIAP激活的TAK1，通过IKK1激酶激活NF-κB，促进炎症、肿瘤的发生与发展[11]。

2.4与其他抗凋亡因子相互作用 Survivin为IAPs的一员，通过BIR直接与XIAP结合，可增强XIAP的稳定性，间接促使XIAP与拮抗物Smac/DIABLO的分离，解除Smac/DIABLO对XIAP的抑制作用，从而增强XIAP的抗凋亡作用[12]。

3 XIAP与肝细胞肝癌

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在全世界肿瘤发生率中排名第5位，死亡率第4位，而我国慢性乙肝携带人群超过人口的10%，是全球HCC的高发区[13]。HCC仅有小部分可以进行切除或进行肝移植，晚期肿瘤患者对现有的治疗方法效果并不理想[14]。

XIAP可以调节Huh7细胞G1期蛋白CDK4、CDK6、cyclin D1的表达，促使肝癌细胞进入G1周期，进而促进HCC细胞增殖[15]。在肝癌细胞系及肝癌组织中XIAP的mRNA及蛋白的表达较正常肝细胞及癌旁细胞的明显升高，这可能是促进肝细胞恶变的重要因素[16，17]。Shiraki研究显示，XIAP高表达与HCC肿瘤细胞的凋亡指数下降有关，与肿瘤的增殖无明显关系。XIAP表达阳性患者3年总体生存率明显低于XIAP表达阴性的患者，复发率也显著升高[18]。复旦大学附属中山医院肝癌研究所研究显示，XIAP高表达除了与HCC细胞凋亡减少有关外，也与HCC体外侵袭能力增强有关[19]。XIAP的高表达是HCC患者无癌生存率及肝细胞癌肝移植术后总体生存率的独立预测因素[18，19]。

在不同分化程度的肝细胞癌（HCC）细胞中，XIAP的表达却无明显区别，提示XIAP与HCC的分化程度无明显相关。在低分化HCC中，XIAP相关因子1（XIAP-Associated Factor 1，XAF1）相反呈明显低表达，这可能与HCC抗凋亡特性有关[20]。Augello研究指出，在HCC组织和肝硬化组织中，XIAP无论在mRNA水平还是蛋白水平均无明显区别。但XIAP的免疫活性与HCC患者预后还是呈负相关。XIAP/XAF1比值在肝癌组织中明显升高，是总体生存率分析中预后不良的预测因子[21]。

由此可见，XIAP在HCC的发生、发展和预后中密切相关，为HCC的治疗提供另一可能的途径。

4 XIAP相关的HCC治疗应用

4.1反义寡核苷酸技术 通过Watson-Crick碱基互补原则，与目的基因或mRNA杂交，抑制目的基因的表达。AEG35156/GEM 640是一段长19bp混合链寡核苷酸，在体外及负瘤实验中显示，引导合成反义寡核苷酸，结合并降解XIAP mRNA，影响XIAP的表达。AEG35156已进入I期和II期临床实验，少量连续多次静脉用药或联合用药，对血液系统肿瘤、黑色素瘤、乳腺肿瘤有抗肿瘤作用[22]，对晚期胰腺导管腺癌患者暂无治疗效果，现在没有有关治疗HCC的报告。

4.2 RNA干扰（RNAi）技术 当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解，导致同源基因表达沉默，RNAi具有高度特异性。这种现象发生在转录后，又称为转录后基因沉默。Chen[23]等构建靶向XIAP的siRNA（short interfering RNAs）质粒，转染人HepG2肝癌细胞，下调肝癌细胞内XIAP的表达，减低肿瘤细胞的生存能力并促进细胞凋亡，增加肝癌细胞对甲氨蝶呤的敏感性。Yamaguchi[24]应用siRNA技术抑制肝癌细胞XIAP或survivn的表达，明显降低procaspase-3表达水平，加入TRAIL（TNF相关促凋亡配体）后细胞凋亡明显增加，增加细胞对多柔比星和喜树碱的细胞毒性。Pan[25]应用腺病毒载体转染HCC，表达抗XIAP的短发夹RNA（shRNA）及TRAIL，在细胞水平及负瘤小鼠中均有效抑制XIAP的表达及显示抗肿瘤活性。

4.3 XIAP抑制物 包括天然的拮抗剂和人工合成的类似物，前者主要包括Smac/DIABLO、HtrA2和XAF1。Smac是一种线粒体促凋亡蛋白，是目前发现的惟一存在于哺乳动物细胞中直接抑制lAP的蛋白。当细胞发生凋亡时，其与细胞色素C一同释放到细胞质中，可以与IAP结合，解除IAP对Caspase-3、7、9等的抑制作用。3种Caspase先后被激活，并发生Caspase级联放大效应，从而加速凋亡[26，27]。免疫荧光研究发现。Smac在正常细胞不诱发凋亡，只在受损的细胞中才促其凋亡。Smac在HCC中表达减少，但是导入外源性Smac并不能诱导HCC凋亡，需要TRAIL才能诱导约10%HCC细胞凋亡[28]。

Smac类似物SM-164加入四种HCC细胞中，虽然可完全引起cIAP-1（IAP的一员）降解，但对HCC细胞的生长抑制作用相当弱，却增强化疗药物的抗肿瘤效应[29]。因而，单独导入Smac治疗HCC能力有限。于是，设计合成更有效的Smac类似物成为可能。Park设计合成以咪唑和噻唑等分子杂环替换肽类片状的非肽类化合物[30]，还有更强结合能力的Smac类似物6j，相比Smac对XIAP的亲和力高24倍，为将来治疗那些因XIAP高表达的耐药性肿瘤提供另外可能的治疗途径[31]。

XIAP相关因子1（XIAP-Associated Factor 1，XAF1）是一种只与XIAP结合的白，拮抗XIAP的抗凋亡作用。XAF1在人体肝癌组织中表达水平低于癌旁正常组织，这可能是影响肝癌术后复发的一个潜在危险因素[32]。重组人TRAIL（rhTRAIL）联合或不联合相重组腺病毒Ad5/F35-XAF1分别加入3株肝癌细胞株SMMC7721、HepG2和Bel-7404中培养，XAF1可明显增加TRAIL诱导HCC细胞凋亡的敏感性，联合应用对不同HCC细胞凋亡有协同作用[33]。

根据XIAP抑制性结合caspase3的原理，人工设计合成出多聚笨基脲1396-12，竞争性结合XIAP的BIR2位点，在体外细胞水平及动物抑制物水平，抑制XIAP活性，诱发急性白血病细胞的凋亡，而对正常造血细胞无明显毒性。在晚期HCC患者，多聚笨基脲可能促使HCC对TGF-β1抑制生长作用敏感，而又不影响正常肝细胞，从而达到治疗HCC的目的。

4.4其他药物通过影响XIAP起作用 砷化物抑制人肝癌细胞增殖，致细胞周期停滞及细胞凋亡，砷化物的抗肿瘤作用可能通过抑制XIAP的表达，这种抑制是剂量依赖性和时间依赖性的。体外实验显示砷化物抑制XIAP的合成及抑制内核糖体进入部位成分（IRES）的活性，减低XIAP的稳定性并促进泛素化降解，XIAP的过度表达会减弱砷化物的促凋亡作用。齐墩果酸（Oleanolic acid，OA）及乌索酸（ursolic acid，UA）可能通过促进细胞线粒体释放细胞色素C，激活caspase9、caspase3及下调XIAP的表达，有效诱导HCC HuH7肿瘤细胞凋亡。在对SMMC-7721肝癌细胞的研究中，岩藻多糖下调Livin及XIAPmRNA，增加Bax/Bcl-2的比率，损耗还原性谷胱甘肽、活性氧（reactive oxygen species，ROS）细胞内的聚集，导致线粒体超细结构、电位的破坏及caspase的激活，从而导致肝癌细胞的凋亡。褪黑激素在HepG2及SMMC-7721肝癌细胞系中，通过COX-2/P13K/AKT途径，明显抑制XIAP及survivin的表达，从而抵消肿瘤细胞的凋亡抵抗能力。XIAP的高表达可对抗5-FU诱导肿瘤细胞凋亡，从而影响化疗药物的抗肿瘤作用，也可能是肿瘤药物耐药的机制[34]。控制XIAP的表达可能增加肿瘤5-FU化疗药物的作用。中药槲芪散通过降低gamma-GT阳性细胞的增殖，线粒体形态的改变，HtrA2/Omi的释放，接触XIAP对凋亡的抑制，激活caspase-3，达到抑制肝癌的形成[35]。

总而言之，肝细胞肝癌的形成是细胞增殖与分化异常的结果，细胞凋亡与增殖的平衡遭遇破坏。XIAP通过各种途径抑制细胞的凋亡，与HCC的发生、发展、转移密切相关，是HCC预后、肝移植预后的独立预测因子，与HCC的复发相关。鉴于XIAP在HCC的高表达，针对XIAP的多种治疗方法也在不断的探索中，其中RNAi技术、XIAP抑制物已证实对HCC有治疗作用，联合化疗药物的治疗更为有效，可能是部分HCC的耐药与XIAP的高表达有关。反义寡核苷酸技术在HCC的治疗研究尚未见报道。其他抗肿瘤药物如砷化物、槲芪散的抗肿瘤作用也可能与抑制XIAP活性有关。因而，针对XIAP的相关治疗可以成为HCC治疗的又一靶标。

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