血管内皮生长因子、血管生成素-2表达及微血管密度与肺癌预后的关系

（延安大学附属医院胸心外科 陕西延安 716000）

［摘 要］目的研究肺癌中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血管生成素-2（angiopoietin-2, Ang-2）表达水平与微血管密度(Microvascular density,MVD)的相关性，探讨三者对肺癌生存率的影响及与生存期的相关性，为判断肺癌预后提供依据。

方法免疫组化法检测96例肺癌手术切除标本中VEGF、MVD表达，western-blotting检测肺癌标本中Ang-2表达变化。

结果肺癌标本中VEGF、Ang-2高表达，MVD高表达组患者5年累积生存率分别为17.2%、16.3%、15.5%，显著低于低表达组（37.5%、31.9%、36.8% ）(P＜0.01)；VEGF、Ang-2基因表达，MVD与术后生存期负相关(P＜0.05)；VEGF、Ang-2基因表达水平与MVD正相关(P＜0.05)。

结论VEGF、Ang-2表达水平越高，MVD越大，肺癌患者生存率越低，生存期越短，是判断肺癌预后有价值的指标。抑制VEGF、Ang-2的表达来降低MVD可能成为治疗肺癌的新靶点。

［关键词］肺癌；血管内皮生长因子；血管生成素-2；微血管密度

［中图分类号］ R734.2

［文献标识码］ A［文章编号］ 1672-4208(2008)21-0004-03

Effects of the Expressions of VEGF and Ang-2 and MVD on the Prognosis of Lung Cancer YANG Yang. Department of Cardiothoracic Surgery, Affiliated Hospital of Yan’an University, Yan’an 716000, China

【Abstract】 Objective To explore the relationship between VEGF, Ang-2 gene expressionand MVD, and their effects on the prognosis of lung cancer.

Methods The expression of VEGF and MVD of 96lung cancer tissues were detected by immunohistochemical staining (LSAB Methods), and of Ang-2 of 96lung cancer tissues were detected bywestern-blotting.

Results The 5-year cumulativesurvival rates of groups with high expression of VEGF and Ang-2 and high MVD were 17.2%, 16.3% and 15.5%, which were significantly lower than that of groups with low VEGF, Ang-2 expression and low MVD(37.5%, 31.9% and 36.8% respectively)(P＜0.01). The survival rate of lung cancer patients was negatively related to the expression of VEGF, Ang-2 and MVD (P＜0.05). The expression of VEGF and Ang-2 in lung cancer tissue was positively related to MVD.

Conclusion The higher expression of VEGF and Ang-2 and higher MVD thetissue presented, the lower survival rateand lower survival duration occurred, so the expression of VEGF and Ang-2 and MVD of tissue can be used to determine the prognosis of lung cancer, and inhibition of the expression of VEGF and Ang-2 and MVD maybe a way of curing lung cancer.

【Key words】 Lung cancer; VEGF; Ang-2; MVD

肺癌是世界上发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤之一，其生长和转移是多因素共同作用的结果，其中血管生成是肺癌侵袭和转移的解剖学和生理学基础，也是影响预后的主要原因，抑制肺癌血管生成也是临床防治肺癌的重要手段之一。本实验研究了血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血管生成素-2（angiopoietin-2, Ang-2）基因表达水平及微血管密度(microvascular density,MVD)在判断肺癌预后中的意义，旨在为临床针对VEGF、Ang-2基因表达进行治疗，提高患者肺癌生存率提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 96例肺癌手术切除标本均来自延安大学附属医院胸心外科1999年1月至2002年5月接受手术治疗的患者，其中男性68例，女性28例；平均年龄（53.16±9.23）岁。腺癌47例，鳞癌38例，腺鳞癌11例。肿瘤直径（4.0±0.3）cm。低分化癌36例，中分化癌39例，高分化癌21例。I+Ⅱ期46例，Ⅲ+Ⅳ 期50例(国际pTNM 分期，UICC1997分期标准)。

1.1.2 主要试剂 兔抗人VEGF多克隆抗体，兔抗人Ang-2多克隆抗体（Santa Cruz），兔抗人F-VIII蛋白多克隆抗体，生物素化标记的羊抗兔抗体，SP复合物(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化检测VEGF表达及MVD 石蜡切片（5 μm厚）常规脱蜡，逐级水化，先经3%H2O2室温下灭活内源性过氧化物酶活性20 min，0.01 mol/L枸缘酸缓冲液行抗原修复，然后依次加入正常小牛血清(1:l0)，VEGF、Ang-1、F-Ⅷ抗体(1:100)，生物素标记的兔抗鼠抗体，生物素标记羊抗兔抗体(1:200)，SP复合物(1:200)。各步之间均经37℃恒温箱孵育30 min，PBS冲洗(小牛血清除外)，最后DAB染色，苏木素复染，树脂封片。用PBS代替一抗体作为空白对照。肿瘤细胞浆或细胞膜显示棕黄色颗粒者为阳性。每张切片于400倍镜下观察3个视野，每个视野观察100个细胞，计算出每张切片上VEGF的阳性表达百分数。表达阳性率≥80%者列为VEGF基因高表达组，表达阳性率＜80%者列为VEGF基因低表达组。微血管定位于癌灶内或间质内，以Weidner计数标准计算肿瘤组织内着色的毛细血管和微血管，凡是由内皮细胞形成的条状、裂隙状等孤立或簇状结构及有管腔者，均记为1条。而血管腔直径大于8个红细胞或管腔可见平滑肌者不记入内。用400倍视野下计数3个视野，取其平均值作为MVD。血管阳性率≥30%者为高MVD组，表达阳性率为＜30%者为低MVD组。

1.2.2 western-blotting检测Ang-2表达 取标本组织，加入5倍体积的PBS缓冲液，4℃匀浆、离心10 min(12000 r/min)，取5 μl上清液，采用考马斯亮蓝法，测定上清蛋白浓度，将所有蛋白样品调至等浓度上样（上样前100℃水浴3 min），以80 V电压常规SDS-PAGE电泳后转移到硝酸纤维膜，用封闭液(1×TBST，5%脱脂奶粉) 4℃封闭过夜，再用抗体稀释液(1×TBST，1%脱脂奶粉)l:250稀释一抗，与经封闭液处理的PVDF膜置于小封口塑料袋内37℃孵育2 h。l×TBST液洗膜3次，每次20 min。然后，以同样方法，l:4500稀释二抗、37℃孵育1 h，1×TBST液洗膜30 min×3次。将膜置于含BCIP（33 μl）/NBT（66 μl）的染色液10 ml，于室温下轻轻摇晃，使蛋白条带逐渐显影、定影，胶片洗涤、干燥，利用Kodak电泳图象分析系统对图片各电泳条带亮度进行扫描，对各组电泳条带的显影相对强度进行统计分析。根据Ang-2相对显影强度将患者平均分为阳性组和阴性组两组。

1.3 病例随访 患者的随访均由我院胸外科完成，随访率为90.6%，失访率9.4%。随访时间为患者出院到死亡或失访，截止时间为2002年5月。失访按死亡病例计算。

1.4 统计学处理 数据利用SPSS 13.0统计软件分析，采用log-rank分析生存率，绘制Kaplan-Meier曲线，P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 VEGF基因表达对肺癌患者术后生存率的影响 VEGF基因高表达组5年累积生存率为17.2%，低表达组5年累积生存率为37.5%；log-rank分析表明χ2=8.300，P=0.004(P＜0.01)，VEGF高表达组5年生存率显著低于低表达组（图1）。

图1 VEGF表达对累积生存率的影响

2.2 Ang-2基因表达对肺癌患者术后生存率的影响 Ang-2基因高表达组5年累积生存率为16.3%，低表达组5年累积生存率为31.9%；log-rank分析表明χ2=10.168，P=0.001，Ang-2高表达组生存率显著低于低表达组(图2)。

2.3 MVD对肺癌患者术后生存率的影响 高MVD组5年累积生存率为15.5%，低MVD组5年累积生存率36.8%；log-rank分析表明χ2=11.061，P=0.001(P＜0.01)，高MVD组生存率显著低于低MVD组(图3)。

图2 Ang-2表达对累积生存率的影响

图3 MVD对累积生存率的影响

2.4VEGF、Ang-2基因表达及MVD与术后生存期的相关性 肺癌中VEGF、Ang-2表达水平及MVD与肺癌患者术后生存期呈显著的负相关(P＜0.05)，VEGF、Ang-2表达水平高，MVD高，生存期短，见表1。

表1 VEGF、Ang-2表达水平及MVD与肺癌生存期的相关性

2.5 VEGF、Ang-2表达水平与MVD的相关性 肺癌中VEGF、Ang-2表达水平与MVD呈显著的正相关(P＜0.05)，VEGF、Ang-2表达水平高，MVD越高，见表2。

表2 VEGF、Ang-2表达水平与MVD的相关性

3 讨论

新生血管形成在肿瘤的持续性生长过程中占有重要作用，与肿瘤的生长、转移及预后的关系密切，已受到越来越多的学者关注。本研究也发现，肺癌组织MVD高的患者生存率明显低于MVD低的患者，而且肺癌组织MVD与患者生存期呈负相关，可见微血管在肿瘤的生长转移过程中发挥了重要作用，可以作为检测肺癌预后的指标之一。VEGF被认为是作用最强、特异性最高的血管生成调控因子[1]，可以促进组织血管的生成。VEGF在体内和体外能够上调内皮细胞的Ang-2的表达[2]，Ang-2 对血管生成的调节具有双向性, 呈VEGF 依赖型，当局部微环境缺乏VEGF 时，Ang-2 有助于血管的退化。当VEGF 等促血管生成因子存在时，Ang-2竞争抑制血管生成素-1（Ang-1）的效应，促进血管结构松解，消除血管基底膜和周围细胞对血管形成的限制，并增加内皮细胞对VEGF 等的敏感性，形成新的毛细血管内皮细胞[3]。Ogawa等[4]的研究表明，在结肠直肠癌的肝转移癌灶中Ang-2和VEGF共同促进了肿瘤性新生血管的形成。Moon等[5]的研究表明，由HCC产生的VEGF和Ang-2以一种旁分泌的形式增加了肿瘤的血供，促进了肿瘤的生长。本实验也观察到，在肺癌组织中，VEGF、Ang-2蛋白表达与MVD正相关，随着VEGF与Ang-2蛋白表达水平的提高，肺癌组织MVD也增高，表明在肺癌组织中Ang-2与VEGF的共同作用下促进了肿瘤新生血管形成，促进了肿瘤进一步发展，患者生存期缩短，生存率降低，提示肿瘤VEGF和Ang-2表达水平也可以作为预测肺癌预后的指标。

尽管VEGF、Ang-2表达水平及MVD作为预测肺癌预后的指标尚待进一步探讨，但抑制VEGF和Ang-2表达、降低肺癌组织MVD似乎是提高肺癌患者生存率、延长生存期的一个可行的办法，然而抑制VEGF和Ang-2表达会不会抑制生理条件的血管形成，以及对提高肺癌患者生存率、延长生存期能起多大作用，都是值得探讨的问题。

参 考 文 献

[1] Naoko I, Yoichi N, Takahiro M, et al. The influence of dendritic cell infiltration and vascular endothelial growth factor expression on the prognosis of non-small cell lung cancer[J]. Clin Cancer Res, 2002, 8:3480-3486.

[2] Zhang L, Yang N. Tumor2derived vascular endothelial growth factor up-regulates angiopoietin-2 in host endothelium and destabilizes host vasculature, supporting angiogenesis in ovarian cancer[J]. Cancer Research, 2003, 63(12):3403-3412.

[3] Lobov IB, Brooks PC, Lang RA. Angiopoietin-2 displays VEGF-dependent modulation of capillary structure and endothelial cell survival in vivo[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2002, 99(17):11205-11210.

[4] Ogawa M, Yamamoto H. Hepatic expression of Ang-2 RNA in metastatic colorectal cancer[J]. Hepatology, 2004, 39(2):528-539.

[5] Moon WS, Rhyu KH, Kang MJ, et al. Overexpression of VEGF and angiopoietin-2: a key to high vascularity of hepatocellular carcinoma?[J]. Modern Pathology,2003,16(6):552-557.

（收稿日期：2008-08-07）