家兔血管外给药对乙酰氨基酚的应用

[摘要]家兔血药浓度法测定对乙酰氨基酚(Paracetamol，APAP)的药动学参数和生物利用度实验是生物药剂学相关课程的重要实验之一，该实验在学生掌握药动学参数及计算方法方面意义重大。为合理配置实验教学资源、提高实验质量，对实验内容和实验模式进行积极地探索性改革。改进的结果显示，采用高效液相色谱法测定APAP含量，可明显减少家兔取血量，简化了血样处理步骤，且检测结果的精确性和稳定性明显提高，同时，也极大提高了学生对该课程的学习主动性和科研兴趣。

[关键词]生物药剂学；药物动力学；教学改革；对乙酰氨基酚；HPLC

生物药剂学作为药剂学的分支学科，有着很强的实践性和综合性，主要以药动力学为研究工具和手段，研究药物及制剂在体内的运动转化过程，并着重厘清药物因素、机体生物学因素与药效间相互作用的科学。为准确评估药物制剂质量、剂型开发、工艺改进、以及临床合理用药的指导提供科学依据，从而确保用药的安全有效[1]。其研究思路、方法与结果影响着药学工作者的科研思维和工作方法，对提高药物研究与临床用药水平起到积极推动作用。近年来，随着生物药剂学学科的飞速发展以及与临床药学、新药研究的高度融合，以及在国家大力扶持中医药事业的大背景下，对中药学专业毕业生的能力要求上也有了新的变化，为满足社会、科学发展需要，许多高校的中药学等相关专业相继开设《生物药剂学与药物动力学》课程，并日渐提升为中药学专业的主干课程。近几年，为适应大学生的发展和社会需求，我校修订了中药学专业培养方案，其中一项重要内容就是将生物药剂学作为中药学本科、硕士研究生的专业选修特色课程。虽然该课程从无到有，实现了零的突破，但是由于课时相对较少，尤其是在实验课时安排上更显窘迫，为了保证在有限的时间内更好地完成教学及实现实验与理论相结合[2]，对实验内容进行积极有效的改进，受到学校和学生的广泛好评。现将实验改进内容和结果归纳汇总如下：

1原实验内容

原实验内容参考林宁老师主编、由中国中医药出版社出版《生物药剂学与药物动力学》(2016年出版)中的“血药浓度法测定口服给药的药动学参数与生物利用度”实验项目[3]，其主要实验内容如下：1.1标准曲线的制备分别取APAP标准品制备20、40、80、120、160、200g·L-1浓度的溶液10mL，精密取1mL、0.5mL空白家兔血浆后加0.12mol·L-1的氢氧化钡溶液3.5mL于试管中，摇匀，放置2min，再加入2%硫酸锌溶液3.5mL，加入纯化水10mL，摇匀，离心机2500rpm离心10min，取上清液3.5~4mL，即为供试品；以纯化水1mL加0.5mL空白家兔血浆混匀同上操作作为参比液，采用紫外分光光度仪于245nm处测定吸收度(Absorbance，A)，以APAP浓度对A为绘制标准曲线并求出回归方程备用。1.2给药与取样家兔称重。给药前耳缘静脉取空白血约2mL，而后家兔口服APAP片(0.5g)一片，约20mL水送服(或同服同剂量的溶液)，给药后于0.25h、0.5h、1.0h、2h、3h、4h、5h、7h耳缘静脉取血约2mL，置试管中。1.3血清中APAP的测定将所取血样置37℃水浴保温1h，取出，以3000rpm离心10min，取血清0.5mL，置10mL具塞刻度试管中，以下按“制备标准曲线”项下方法操作，并以按同步操作的空白血清样品做参比，紫外分光光度仪λ=245nm处测定APAP含量，根据1.1获得的标准曲线，计算血清中APAP的含量。1.4.数据处理应用残数法求算APAP的药动学参数。

2实验改进

原实验内容是评定药物制剂生物利用度的经典方法，通过测定血药浓度可获得药物在体内的瞬时数据，相较于尿药检测更为理想。且采用紫外分光光度法测定APAP含量，操作简单、结果准确、专属性也较强，广泛应用于学生的实验中。但是，由于学生的操作熟练程度不够，血液样品处理时常常有血样中的蛋白处理不够彻底，而干扰APAP含量测定的准确性；并且，采用氢氧化钡和硫酸锌去除蛋白的方法干扰因素较多，重现性较差，即使同一血液样品，不同学生进行处理操作，所测得的吸收度也不同；再者，我校由于《生物药剂学与药物动力学》课程的实验课时安排较少，为合理安排实验项目，我们对APAP的测定方法包括紫外分光光度法[4]和HPLC[5-6]法进行文献检索、多因素比较衡量，通过预实验，最终确定较为合理的给药方法、血样处理以及血样中APAP的检测方法，现汇总如下。2.1HPLC条件及方法学考察由生物药剂学兴趣小组完成。2.1.1色谱条件[7]色谱柱：ODSC18柱，460*250mm，5μm；流动相：甲醇-乙酸铵溶液(0.05mol·L-1)=10∶90；检测波长：245nm；流速：1.0mL·min-1；进样量：20μL。2.1.2溶液制备2.1.2.1APAP标准品溶液以流动相作溶剂配制APAP标准品储备液1.0mg→10mL，取其0.50mL，流动相稀释至10mL，混匀，过滤，得标准品溶液(APAP浓度：4.95μg·mL-1)。2.1.2.2样品溶液家兔称重，以剂量为100mg/kg灌胃给药APAP，30min后自耳缘静脉取血至肝素化试管中，3000rpm离心10min，取血浆0.20mL，加1.80mL流动相稀释，混匀，0.22μm微孔滤膜过滤(下同)，作供试品溶液。2.1.2.3阴性对照溶液精密取纯化水0.50mL，加空白血浆1.00mL，流动相稀释至10mL，混匀，过滤，作为阴性对照溶液。2.1.3系统适用性考察分别取APAP标准品溶液、供试品溶液、阴性对照液，按照2.1.1色谱条件检测，结果如图1所示，仪器基线平稳，APAP的保留时间RT=18.389min，峰形尖锐，理论塔板数高于8000，样品的分离度高，由家兔空白血浆制备的阴性对照溶液在该位置上无干扰峰，表明该方法可用于家兔给药后APAP血药浓度的测定。2.1.4标准曲线量取APAP标准品储备液1.00mL稀释20倍，过滤，分别进样10、20、30、40、50μL，测定各进样量的APAP峰面积，以峰面积(y)对浓度(x)进行线性回归，制作标准曲线。得标准曲线方程y=66551.96x+236.5(r=0.9999)，线性范围：2.475~12.375μg·mL-1。2.1.5精密度考察取2.1.2.1中的APAP标准品溶液，进行精密度考察。结果：APAP含量的标准误RSD%为0.22%(n=5)，显示该台HPLC仪器良好的精密度。2.1.6重复性考察按照2.1.2.2供试品溶液制备方法平行操作，获得5个供试品溶液，分别测定APAP含量，并计算其标准误RSD%为0.46%(n=5)，显示该检测方法的重现性良好。2.1.7回收率考察按照2.1.2.2方法制备APAP供试品溶液15mL，分别精密量取该供试品2.5mL，以稀释10倍的标准品储备液补充APAP含量，使之分别相当于供试品标示量浓度的80%、100%、120%，定容至终体积为5mL；测定溶液中APAP含量，并计算各加样回收率。结果如表1示，其回收率的均值为103.80%，RSD%=2.70%(n=9)，表明在此检测条件下测定APAP含量的合理性、有效性。2.2家兔给药方法、血浆取样及样品处理方法家兔(雌兔应未孕)称重，灌胃给药给对乙酰氨基酚片剂100mg/kg。分别于给药前、给药后10min、20min、30min、60min、90min、2h、3h、4h、5h、7h耳缘静脉取血约0.8mL至肝素化EP管中。取样期间，家兔自由进水进食。各血样经3000rpm离心10min，取上层血浆按照上述供试品溶液处理和测定方法测定APAP的含量。2.3计算药物动力学参数以及生物利用度取该实验学生获得的实验数据，求算APAP血药浓度，以血药浓度的对数(lgC)与时间(t)作图，得药时曲线。应用残数法求算APAP的药动学参数，包括消除速度常数(k)、吸收速度常数(ka)、半衰期(t1/2)、表观分布容积(V)以及峰浓度(Cmax)、达峰时间(Tmax)、药时曲线下面积AUC和生物利用度F，结果如图3。

3讨论

生物药剂学的实验教学是理论教学的重要补充内容，注重培养学生的科学态度和动脑、动手能力，也是培养学生综合素质的重要手段[8]。采用家兔血药浓度法测定APAP血管外给药的药动学参数及生物利用度是中药学专业《生物药剂学与药物动力学》以及硕士研究生《生物药剂学与药物临床试验》课程的主要实验内容之一，对于学生理解掌握药物在体内过程、药动学参数意义以及在药物临床研究中的应用等方面有着非常重要的指导意义。在该实验项目中，家兔的采血成功与否、血样中干扰因素去除的彻底性以及血药浓度检测的准确性是实验成功的关键因素。本文在参考相关教材、文献的基础上，综合学校课程设置、实验条件以及学生的操作水平，对家兔取血量、样品的前处理、以及APAP的分析检测方法进行改进：(1)在实验前期，由该课程的兴趣小组对APAP的HPLC检测方法学进行摸索、确定。制作APAP的标准曲线，求算回归方程及相关系数并对方法学进行考察；(2)体内血药浓度测定实验由全体同学参与，分组实施，实验内容按照“2.家兔给药方法、血浆取样及样品处理方法”进行取样及处理；(3)求算药物动力学参数以及生物利用度。通过实验数据以及以往文献资料显示，APAP属于单室模型药物，各实验组以血浆中APAP浓度的对数(lgC)与时间(t)作图，得药时曲线。实验结果发现，给药后2h、3h、4h、5h、7h的对数浓度与时间的线性关系显著，表明灌胃给药对乙酰氨基酚2h后即即进入消除相，并由该5个点获得APAP的消除速度方程lgC=-0.174t+2.608(r=-0.990)，进而求得10min、20min、30min、1h的残数浓度(Cr=C外推-C实际)，利用该4个点的对数残数浓度对时间作图，获得回归方程lgCr=-0.961t+2.655(r=-0.999)。利用以上数据及方程，求算APAP的药动学参数，如图3。改进后的实验方法和以往实验方法相比，其优点在于：(1)采血量减少。由于采血方式为耳缘静脉采血，血流较慢，瞬时可取血量较小，而且，在本实验中取血时间点设计比较密集，加之学生的操作水平不高，很难在规定时间点取出足量的血液供紫外分光光度法进行APAP的含量检测，并且，由于多次采血，多个实验组在2h以后几乎无法继续采血，导致实验失败。而改进后的实验取血在0.8±0.2mL即可达到检测要求，大大降低了取血难度，保证各时间点的顺利采血，从而保证圆满实验。(2)血样处理简单化。家兔取血后离心取血浆，加流动相稀释10倍，混匀，0.22μm微孔滤膜过滤，即可。大大简化了血样的去除蛋白等杂质的操作过程。(3)提高检测结果的准确度。采用HPLC方法进行APAP的含量检测，相对比于紫外分光光度法，测得的结果更加精确、稳定，专属性更强(结果见图1、表1)。(4)缩短实验学时。由于给药和血样处理的简单化，并直接采用HPLC的样品检测批处理操作，可明显缩短实验时间，更加贴合我校生物药剂学的课程设置。在以后的实验过程，拟对以下环节进行改进优化：(1)取样时间的优化。在保证APAP消除速度方程准确求得的前提下，缩短消除相的采血时间；增加吸收相的采血点，使得吸收相的时间点更加密集，并在峰浓度时设置采血点，让整个实验更加贴近药物在体内的实际过程。(2)加强学生的操作训练。包括耳缘静脉取血的技术技巧性、移液器使用的规范性、HPLC操作的正确性等方面进行指导、培训，以满足该实验的操作准确性要求。(3)实现实验属性的转型。如采用不同的给药途径(如肌注与口服)，对二者的药动学参数、生物利用度对比；或者不同剂型间的药动学参数、生物利用度进行对比，将此验证性实验逐步向研究型实验过渡[9]，并准备在研究生课程中推进中药有效成分的药动学参数估算的探究性实验。

4结论

总之，由于实验教学目标的多维度性和多层次性，如通过实验对理论的理解、动手能力的训练、科学工作方法、工作思路的训练、科学兴趣的培养等[10]，反过来，科研性质的实验探索又可以构建学生的理论知识网络[11-12]，从而促进教学。并且，在今后的教学过程中，逐步优化教学过程，积极开拓实验教学的新内容，并继续应用于中药学硕士培养中，实现该课程的本-硕实验贯通[13]。并着力训练学生的科学性思维，提高学生的能动性、创造性。

作者：王红芳 李春花 张璇 王捧英 刘时乔 李国川 单位：河北中医学院药学院 河北中医学院基础医学院 河北中医学院实验中心