影响ELISA检测HBsAg结果的常见因素

【摘要】目的:探讨血清标本因素对酶联免疫吸附法(ELISA)检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)结果的影响。方法:用同一批号试剂对不同状态的血清标本进行同步检测，并对结果进行综合比较分析。结果:引起结果错误的主要原因是有溶血或浑浊的血清。结论应针对血清标本的具体情况进行不同的处理。

【关键词】酶联免疫吸附试验；乙型肝炎表面抗原；抗凝剂

【中图分类号】R524【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)04-0180-02

酶联免疫吸附法(ELISA)检测HBsAg因具有灵敏度高、特异性强等优点而被广泛应用，但在日常工作中检测HBsAg常遇到假阳性率高、重复性不好的现象。HBsAg假阳性结果易给广大体检人员造成大的精神压力，易引起体检人员对检测人员的投诉，同时对检验机构易造成不良的声誉[1]。针对这一现象，为了使检验结果更加准确、假阳性率更低，笔者采用同一种试剂对不同的血清标本进行重复测定分析，现报告如下。

1 资料与方法

1．1 血清标本采静脉血做乙肝两对半的血清标本均来自来我院进行单位职工年度体格检查。

1．2 试剂和仪器上海科华生物工程有限公司生产的乙肝HBsAg酶联免疫试剂盒，深圳雷杜酶标仪和洗板机。

1．3 分组和检测方法严格按照说明书进行操作，在操作过程中，小心吸取血清，避免人为造成影响[2]。分3类情况进行观察。A组：不抗凝血液标本：取96份不抗凝血液标本，每份分为三管，分别静置0．5、1、2 h后用3 000r／min离心l5 min，取出血清分别检测HBsAg。B组：加抗凝剂标本：采集50份静脉血标本，每份标本分别用不抗凝管、肝素钠抗凝管、EDTA一2Ka管、枸橼酸钠管这4种管各装l管，其中不抗凝标本静置2 h后3 000 r／min离心15 min，另3管静置2 h析出血浆。c组：含血细胞标本：从体检人员中抽出45例健康人血液标本(HBsAg阴性者)。取45份血清和血细胞每份血清1．2 mL，血细胞0．2mL。把0．2 mL的血细胞加生理盐水，校正红细胞计数为1．0×1012•L-1，然后按表1进行稀释制成含有不同血细胞的血清标本，然后对含有不同浓度血细胞的标本进行HBsAg的检测。

2 结果

2．1A组不抗凝标本HBsA9检测结果标本自凝0．5、1、2 h的HBsAg阳性率分别为l0．42％(10／96)、3．12％(3／96)和0。

2．2B组加不同抗凝剂标本HBsA9检测结果依照不同血液处理方式，不抗凝血、EDTA一2K抗凝血、肝素钠抗凝血、枸橼酸钠抗凝血的HBsA9阳性率分别为0、0、8．0％(4／50)和0。

2．3C组合有不同浓度血细胞标本HBsAg检测结果随着标本中含血细胞浓度的增高(0．0625×1012•L～-10.125×1012•L～-1、0．250×1012•L～-1)，检测HBsAg阳性率也随之升高，依次为6．7％(3／45)、77．8％(35／45)和100％(45／45)。

3 讨论

血液中心和血站对供血者健康检查标准中HBV的筛查要求也是HBsAg阴性[1]。因此，HBsAg检测的结果是否准确具有非常重要的意义。血清是最常用的ELISA标本，血浆中除含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成分等同于血清，除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本[3]。用ELISA一步法检测乙肝两对半，简化了操作步骤，缩短了检验时间；同时，应用高亲和力的单克隆抗体或，高纯度抗原，检测的敏感性和特异性都有显著提高。但实验原理、实验步骤及工作人员等因素也会影响ELISA的检测结果[3]。

3．1 不抗凝血液标本本研究结果显示，在血液自凝时间为0．5 h和1 h时就强行分离血清检测HBsAg的假阳性率分别为l0．42％和3．12％。而在体检人员健康检查工作中，有时为了争取时问快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行分离血清进行检测，易造成假阳性结果。这就可以解释，若在次日复查同一标本时，因血液已经完全凝固，血清中没有纤维蛋白原的存在，故复查结果可以变为阴性。血清分离不彻底的原因主要有以下几个：①血清中残留部分纤维蛋白原，易黏附于反应孔壁，或在孔中发生凝集，这两种情况都可以将酶结合物吸附于孔中，而使洗涤无法洗干净，从而造成假阳性结果。②纤维蛋白原的物理阻隔和反应微环境的改变，使检验灵敏度降低，易造成假阴性的结果[3]。

3．2 加抗凝剂标本本研究结果显示，肝素钠抗凝的标本出现假阳性，阳性率为8．0％，其余均为阴性。原因可能是抗凝剂在抗凝的同时合成结合物，抑制或促进ELISA系统中辣根过氧化物酶异常显色，导致结果不一。

3．3 含血细胞标本ELISA方法测HBsA9的检验过程中，很多情况下的血清为带血细胞标本，红细胞的亚铁血红素具有过氧化物酶的活性，如果反应孔因非特异性吸附红细胞，加入底物后产生显色反应，就会造成假阳性结果[4]。本研究结果显示，随着血细胞浓度的提高,假阳性的比例也呈上升趋势，当血细胞的浓度达到时0．25×1012•L～-1。时，HBsAg假阳性率达到l00％。

3．4 解决方法临床上个别标本由于上述因素而影响结果，造成假阳性的产生。本文对常见的影响因素做了以上的实验探讨，另外也查阅文献资料，对提高ELISA检HBsAg的准确性做出以下几条建议：①当天气寒冷时，采集的血液标本应置于孵箱孵育足够的时间；临时采集的标本不应进行强制分离。建议工作人员采集的血液标本应置于37％孵箱孵育1．5～2 h。②要避免标本出现严重溶血，血红蛋白中含有血红素，有类似于过氧化物酶活性[5]，因此在以HRP为酶标记的ELISA测定中，如血清中的血红蛋白浓度过高则很容易在温育过程中，吸附于ELISA包被板，从而与后面加入的HRP底物反应显色，因此要克服上述干扰，采集血标本时应尽量避免溶血。③血清不能用肝素纳抗凝，因为肝素纳在ELISA测定过程中抑制酶活性，属于酶抑制剂。

参考文献

[1]ZAAIJER H L，VRIELINK I-1，KOOT M．Eady detection of hepatitis B surface antigen and detection of HBsAg mutants：a company son of five assays[J]．Vox San9，2006，81(4)：219-221

[2] 高菊华，高海英．不同温育时间的酶联免疫法对HBsA9结果的影响[J]．中国卫生检验杂志，2008，10(5)：606

[3] 许斌，朱虎定．ELISA检测HBsA9影响因素的探讨[J]．I临床检验杂志，2006，18(4)：232

[4] 龙宪和，童华诚．溶血对乙型肝炎五项血清标志物检测结果的影响[J]．中华医学检验杂志，2007，19(1)：47-48

[5] 靳敏．溶血对临床生化检验影响的探讨[J]．广西医学，2007，24(9)：1363-1364

[6] 郑怀充，韩松．临床检验．ELISA指南[M]．北京：北京医科大学、北京协和医科大学联合出版社，2005：40

作者单位：517100 连平县人民医院

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