细胞DNA定量分析方法普查宫颈癌的临床探讨

摘 要:本文通过对参与子宫颈癌普查的3000名妇女取材,进行液基薄层制片,然后分别进行巴氏染色和DNA染色。由细胞病理学医生对巴氏染色片子做常规细胞检查,用全自动DNA倍体分析系统对DNA染色片子进行自动扫描诊断。对常规细胞检查结果在LSIL以上病例和全自动DNA倍体分析系统检查可见异倍体细胞或异倍细胞峰的病例,建议进一步做阴道镜检查以及子宫颈活检。细胞DNA定量分析方法在有条件的降低特异度情况下,能明显提高宫颈癌普查的阳性检出率。

关键词:细胞DNA定量分析;全自动DNA倍体分析系统;宫颈癌;常规细胞学

中图分类号: F592.3 文献标识: A 文章编号: 1007-4244(2010)09-0121-06

子宫颈细胞学检查是检测宫颈癌及癌前病变的主要方法。在发达国家,对育龄妇女每年或每两年进行一次宫颈癌的普查,从而使子宫颈癌的发病率及死亡率明显下降。而在我国大部分地区,尤其是西部地区尚没有开展由政府统一组织规范的大规模子宫颈癌普查。除组织管理、经费不足及人们的预防意识尚有差距外,技术上的主要障碍是缺乏专业培训过的细胞学医生。此外,由于样本收集及制片的误差,致使子宫颈癌诊断的假阴性率可高达20%~47%。过去30年来,子宫颈细胞学的检测技术和方法不断地提高和发展,尤其是在取材和制片方法上取得了较大进展,使子宫颈癌检出率明显提高。例如用子宫颈刷来取代子宫颈刮板,液基薄层制片取代常规直接细胞涂片。然而对于大多数发展中国家而言,仅有高质量的取材制片技术是不够的。提高子宫颈病变筛查检出率,减轻子宫颈筛查工作中的人工劳动强度及所造成的人为误差,将有利于我国开展大规模高水平的子宫颈普查。本研究在采用液基薄层制片技术的基础上,利用高性能、全自动DNA倍体分析系统,进行子宫颈癌筛查的研究,试图探索一种自动化程度高、经济实用的子宫颈癌普查方法。

一、材料和方法

我院对3000名妇女进行了子宫颈癌筛查。被检查妇女的年龄多数在21~75岁之间。被检测的绝大多数为白银市育龄妇女最小21岁最大75岁,以往从未做过子宫颈细胞学检查。子宫颈癌普查试剂盒由北京肿瘤早期诊断检测中心提供,其中包括:子宫颈刷、盛有固定液的标本管、标签、申请单等。经过培训后妇科医生在白银市妇幼保健院取材。

(一)取材

妇科医生在阴道扩张器直视下,用大棉签轻轻拭去宫颈及阴道的分泌物,然后手持子宫颈刷的刷柄,将刷头中央较长的刷丝从子宫颈外口插入子宫颈管内(约8mm)处,周边刷丝顶部抵触在子宫颈黏膜面,顺时针或逆时针旋转3-5圈,取出宫颈刷后,拔脱刷头,将刷尖向下垂直方向浸泡在样本收集管固定液内,旋紧管盖后振荡摇晃,然后将贴上标签的标本管送到细胞实验室制片(对于制片失败的患者重新取材)。

(二)液基薄层制片及染色

将装有固定液和刷头的标本收集管,加入0.1%DTT消化液放在振荡器上振荡2小时,然后将消化后的细胞悬液离心5分钟(800转/分),弃上清液后,加50%乙醇分别清洗、离心两次(800转/分×5分钟/每次)。然后将用固定液稀释的细胞混悬液,放入细胞涂片离心机甩片5分钟,每例制成2张薄层细胞学片,其中1片进行巴氏染色做常规细胞学诊断,另外1片进行福尔根(Feulgen)DNA染色做DNA定量测定。

(三)细胞学诊断

所有巴氏染色片子经两位有经验的细胞病理医生读片。根据Bethesda诊断分为5组:1.正常或良性;2.非典型鳞状上皮增生(ASCUS,Atypical squamous Cells of undermined significance);3.低级别鳞状内皮癌变(LSIL,Low-grade squamous intraepithelial lesion);4.高级别鳞状内皮癌变(HSIL,High-grade squamous intraepithelial lesion)或原位癌(CIS,Carcinoma in sita);5.鳞状上皮癌。

(四)细胞DNA定量分析

所有福尔根染色片用AcCell全自动细胞图象分析系统进行扫描处理,该系统已达到欧洲定量细胞病理学会所制定的有关DNA定量分析图像系统的各项标准。细胞片染色质量控制用HL60细胞株片子作对照。一般情况下,AcCell系统对每张玻片上6000个以上的细胞核进行扫描测定。经扫描后的每个细胞核均有123个特征值,其中包括形态特征、吸光特征、具体结构特征、Markovian和非Markovian结构特征和长度特征等。AcCell系统根据不同细胞成分所具有的不同特征参数来完成自动细胞分类和计数过程,如正常上皮细胞,增生或癌变细胞,淋巴细胞,中性白细胞及未参与诊断的垃圾细胞。(重叠细胞核,聚焦不良细胞核和核碎片等)。标准对照细胞为同张玻片上的100个正常上皮细胞,所测出的平均光密度(Intergrated Optical Density IOD)为2C的参考值,其CV(Coefficient of Variation)值小于5% 。

根据AcCell系统诊断软件所做的细胞DNA倍体分析结果和建议有如下三种情况:1.正常2C细胞为主,未见异倍体细胞及异倍体细胞峰;如图2DNA检测没有异常,属于正常2倍体分裂,这样的病人,我们一般建议1~2年后复查。

2.出现DNA指数大于2.5细胞及DNA指数1与2之间的细胞数超过被测细胞总数的10%如图1B,DNA检测有异常:细胞不属于2倍体分裂,指数大于2.5,有3个病变细胞,增生的细胞总数大于10%。这样的病人我们建议活检同时给予药物治疗。建议活检,4-6月后复查。

3.出现异倍体细胞峰及大量DNA指数大于2.5细胞如图3CDNA检测出现大量的病变细胞。DI>2.5可见大量DNA倍体异常细胞,我们均建议活检,进一步治疗并定期复查以免病情发展

凡是有DNA指数大于2.5细胞的玻片,都要通过细胞技

术员在显微镜下逐一进行核实,以排除AcCell系统将垃圾和重叠的细胞核误认为癌细胞或异常细胞。

(五)阴道镜及病理学检查

凡是子宫颈常规细胞学检查在LSIL及以上级别或DNA定量分析结果建议做进一步临床检查的妇女,均建议进行阴道镜的检查并对子宫颈可疑部位进行四点以上的组织活检。每例活检样本由有经验的病理学医生出病理诊断报告。病理诊断报告分别为正常、子宫颈炎、CIN1、CIN2、CIN3或原位癌及浸润癌。

二、结 果

(一) 二种不同细胞学方法的筛查结果

在3000例合格的子宫颈样本中,常规细胞学检查发现2838(94.66) 例正常,162 (5.33%)例为异常,异常包括 34(2.12%)例为ASCUS,31(1.89%)例为LSIL,22(1.34%)例为HSIL,12 (0.04%)例为子宫颈癌。而在同样的样本中,经AcCell系统筛查发现2745(91.50%)例为阴性,未见DNA指数大于2.5细胞,无异倍体细胞峰,255(8.50%)例为阳性(有DNA指数大于2.5细胞或异倍体细胞峰)。 我院取158例活检病人,病理诊断结果证实,在6例子宫颈癌的病例中,常规细胞学诊断为高级别以上子宫颈病变的为2例,而细胞DNA倍体分析法出现有异倍体细胞的达5例。在11例CIN3/原位癌的病例中,常规细胞学诊断为高级别以上子宫颈病变的仅有2例,而细胞DNA倍体分析法阳性则有9例(表1和表2常规细胞学及DNA异倍体5C分析与病理结果比较)。

(二)敏感度和特异度

用158例子宫颈活检病理诊断结果为标准,分别计算出常规细胞学和DNA定量分析诊断方法的特异性和敏感度(表2)。在158活检病例中,发现11例CIN3及以上级别的子宫颈疾病中,6例为CIN3/CIS,5例为浸润性子宫颈癌。若将LSIL定为筛查后需做活检标准,常规细胞学诊断的敏感度为53%,特异度为46%。在158例活检病例中,经细胞DNA定量分析系统筛查出阳性病例为53例,阴性为105例。若将1个或超过1个DNA指数大于2.5细胞定为筛查后需做活检标准,CIN3以上病变的敏感度、特异度分别为82%和71%。若将3个或超过3个DNA指数大于2.5细胞定为筛查后需做活检标准,CIN3以上病变的敏感度、特异度分别为85%和73%.如以3个以上DNA指数大于2.5细胞为活检标准,测定子宫颈癌的敏感度、特异度分别为93%和83%。

(三)常规细胞学与DNA定量分析诊断方法的一致性

经常规细胞学诊断为子宫颈癌和HSIL的病例中,分别有88%和84% 的病例出现异倍体细胞或异倍体细胞峰。而只有53%LSIL病例,18%ASCUS病例发现有DNA异倍体细胞或异倍体细胞峰,这充分说明常规细胞学与DNA定量分析诊断方法是一致的。

三、讨 论

用DNA倍体分析系统进行子宫颈癌及癌前病变的诊断在国外已有大量报道。而且,细胞DNA定量分析诊断方法在北美及欧洲已是作为一种常规临床检测方法之一。用全自动DNA倍体分析系统进行子宫颈癌普查的临床研究在国内外尚属首次。本研究用全自动细胞DNA定量分析方法不作为诊断方法,而作为一种筛查方法,挑选出少数子宫颈癌高危人群做进一步检查,如活检,最后由病理医生确诊。这一筛查原则在降低细胞病理医生工作量,提高阳性检出率,减少追踪复查人群等方面,取得了良好效果。我们将细胞DNA定量分析方法筛查的目标对象定在HSIL级别以上的子宫颈病变。因此,与常规细胞学(TBS)诊断方法相比,在筛查过程中DNA定量分析方法的敏感度提高,但特异度降低。其结果是有更多的早期子宫颈癌患者被发现因而能及时得到进一步的临床确诊和治疗。而其中少数被误判为阳性需做活检的病例,经病理证实无明显异常后,无需做任何进一步处理。由于活检不影响受检者的正常工作和生活,不会使受检者受到伤害,与更多的早期子宫颈癌病例的误诊相比,只要将活检人数控制在尽可能小的范围内,付出这种代价应该是允许的。

在研究中发现,DNA倍体异常细胞可出现在阴道镜下子宫颈外观完全正常的受检者,而病理活检结果证实为子宫颈癌。在TBS诊断为正常的9例病例中,有7例出现DNA指数大于2.5细胞,经病理活检证实这些病例均为早期子宫颈癌。上述结果表明,在液基薄层制片基础上,细胞DNA定量分析方法较常规细胞学方法在子宫颈癌的早期发现诊断方面有更大优势。两种方法对早期子宫颈癌敏感性不同的原因可能是细胞DNA定量分析方法是一种根据细胞核DNA含量改变所做的客观判断。而常规细胞学诊断是医生根据细胞形态的改变所做的判断,带有一定主观性。而且医生无法在显微镜下观察到细胞癌变早期核内DNA含量及其结构的改变。

我们的结果显示,按TBS分级的各级子宫颈病变,均可发现有DNA倍体异常细胞,即DNA指数大于2.5(5C)细胞。病变级别越高,DNA倍体异常细胞和异倍体细胞峰出现频率越大。这与国外相关报道一致, 即在大多数子宫颈癌和HISL病例中可出现DNA倍体异常细胞。 ASCUS和LSIL病变中如出现DNA异倍体细胞,提示有进一步发展趋势和高危型HPV感染的可能。因此,用出现DNA指数大于2.5(5C)细胞作为筛查阳性指标是合理的。国外有用DNA指数大于4.5(9C)细胞作为细胞病理临床诊断阳性标准,其特异度很高,但敏感度低。此标准用于临床诊断可以,但不适用于筛查。

是否用DNA倍体分析系统发现有异倍体细胞就是子宫颈癌呢?显然不是。从我们实验中发现以及国外有关资料显示,除HPV感染等因素以外,经放疗后的患者和激素水平紊乱的老年妇女也可出现子宫颈异倍体细胞,正是这些因素使细胞DNA定量分析方法的特异性降低。因此,在用细胞DNA定量分析方法进行子宫颈癌筛查时,严格按照根据病理活检诊断作为确诊和临床进一步治疗的依据。从而避免因假阳性筛查结果给受检者带来精神负担和临床上的过治疗。

大量资料表明,子宫颈癌主要危害经济条件差和无条件参加子宫颈癌普查地区的妇女。中国人口众多,经济发展不均衡,如何使大多数妇女参与子宫颈癌普查是当今面临的必须解决的问题之一。在分析总结各种子宫颈癌筛查方法的经验基础上,一方面,本研究采用子宫颈刷取材和国产化的液基薄层制片技术,同时使用扫描和诊断过程全自动化的DNA倍体分析系统进行筛查。 另一方面对基层妇女进行宣传教育,使她们了解子宫颈癌早防早治的意义,受到了广大育龄妇女的欢迎并积极参与。经过大力宣传,主动参加全自动DNA分析系统进行子宫颈癌普查的基层妇女人数增长。实践证实用全自动DNA倍体分析系统进行子宫颈癌普查有效地解决了在基层开展大规模子宫颈癌普查缺乏应有的技术和欠缺有经验细胞学医生的矛盾。同时该方法敏感度较高,成本效益合理,应作为一种适合于基层大规模妇女普查的子宫颈癌筛查方法。

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