新陆早细胞胚植株再生

【前言】新陆早细胞胚植株再生由文秘帮小编整理而成，但愿对你的学习工作带来帮助。2结果和分析 2.1不同激素组合对愈伤组织的诱导下胚轴切段在CIM愈伤组织诱导培养基上培养7d后，下胚轴外植体开始膨大并产生愈伤组织。4种激素组合均能诱导愈伤组织(图1-A－D)，愈伤组织诱导率在2个品种间或4种激素组合间不存在显著性差异（表2）。诱导出愈伤组织的状态...

新疆是我国最大的棉花种植基地，约占中国棉花种植面积的1/3。新疆棉花以色泽洁白，纤维品质好而深受棉纺织企业和消费者青睐。但新疆地处中国大陆西北，气候干旱少雨，土地的沙漠化、盐碱化和次生盐碱化严重，棉田连作造成棉花病虫害逐年加重，加之天气灾害如霜冻、冰雹等造成不利影响。因此，新疆棉花品种的改良,尤其是针对新疆特定生态条件而开展的抗旱、抗病、抗冻、高产、优质、早熟等品种培育,将给新疆棉花生产带来更大的发展。目前生物技术是加快育种步伐的有效方法之一。在新疆陆地棉中，已有不少品种如新陆早1号、新陆早4号、新陆早7号、新陆早8号、新陆早10号、新陆早17、新陆早32号、新陆早33号、新陆中2号、新陆中4号等通过体细胞胚胎发生成功再生植株[1-7]，研究证明以棉花胚性愈伤组织为受体体系进行遗传转化是高效、简易的转基因途径[8-11]，但其前提是具有体细胞胚胎发生的棉花品种。新陆早42号（代号垦62）是以新陆早10号为母本，新疆农垦科学院自育品系97-6-9为父本进行杂交，通过多年病地定向选择而成。其具有早熟，丰产性强，纤维品质优良，抗枯萎、耐黄萎病等特点，为新疆新陆早系列综合表现优良的品种[12]，广泛适应于北疆、南疆等早熟棉区种植。新陆早42号是新疆最新推广栽培的陆地棉品种，2010年农业部在西北内陆棉区推广的农业主导品种和主推技术，深受棉农欢迎。新陆早33是新近报道的具有高频胚胎发生能力的一个新疆主栽品种[1]。拟以后者为对照，研究新陆早42号的体细胞胚胎发生能力，寻求建立新陆早42号有效的体细胞胚胎再生体系，为扩展棉花再生基因型和通过转基因对新陆早42优良品种进行直接改良奠定基础，最终为通过转基因提高新疆棉花抗旱、抗冻、抗盐等抗逆性和产量提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料来源棉花品种新陆早42号（简称“新陆早42”）、33号（简称“新陆早33”）由新疆石河子农业科技开发研究中心艾尼江博士提供。

1.2试验方法试验使用浓硫酸脱绒种子，依次用70%酒精浸泡30s，10%过氧化氢消毒2.5～3h，无菌水冲洗3次，再置于无菌水中28℃浸泡24h，种子露白后剥去种皮，接种在1/2MS无机盐＋0.25%（W/V）Phytagel培养基上，在培养间于28℃散光培养5d待用。将无菌苗下胚轴中部切为5～7mm大小切段，接种于CIM(Callusinductionmedium,CIM)愈伤组织诱导培养基。CIM培养基由MS无机盐＋B5维生素(以下简称MSB)＋葡萄糖3%(W/V)＋Phytagel0.25%(W/V)组成，辅以4种激素组合(表1)。在愈伤生长30d后，取下在不同激素的CIM培养基上诱导的愈伤称量，计算单块愈伤质量（表2）。培养50d后，将分化的胚性愈伤组织转至MSBF培养基[基本组成与CIM培养基相同，KNO3加倍，去除NH4NO3无KT和2,4-D激素，附加谷氨酰胺0.1%(W/V)和天冬酰胺0.05%(W/V)]。同时，将未分化愈伤组织继代于MSBP培养基[基本组成与MSBF培养基相同，不附加谷氨酰胺0.1%(W/V)和天冬酰胺0.05%(W/V)]进行增殖和诱导体细胞胚胎发生。体细胞胚发生后，各发育阶段的体细胞胚均培养于MSBF培养基，直至分化成苗。培养期间辅以特定的透气胁迫和营养胁迫处理[13]，即在MSBF培养基上铺垫滤纸和间期地使用强透气的透气膜封口以促进体细胞胚胎发育成熟。所用培养基以121℃高压灭菌15min，灭菌后pH为5.8～6.2。所有培养物均置于(28±2)℃，光照强度冷光源135μmol•m-•2s-1，每天光照16h进行培养。

1.3实验设计和数据分析试验设3个重复，每品种的30个切段为1个重复。对出愈数、30d愈伤组织质量、愈伤组织胚胎发生率进行数据分析，数据分析由Excel2003和中国水稻所的统计分析软件AnovaAnaly-sis.xls完成。

2结果和分析

2.1不同激素组合对愈伤组织的诱导下胚轴切段在CIM愈伤组织诱导培养基上培养7d后，下胚轴外植体开始膨大并产生愈伤组织。4种激素组合均能诱导愈伤组织(图1-A－D)，愈伤组织诱导率在2个品种间或4种激素组合间不存在显著性差异（表2）。诱导出愈伤组织的状态在不同激素组合间和不同品种间有明显的表观差别（表2）。分析表明培养于2，4-D和KT组合培养基上的愈伤组织比培养于IBA和KT组合培养基上的愈伤组织增殖显著。CIM培养基上培养50d两种材料的形态比较：添加2，4-D和KT组合的CIM1培养基所诱导的愈伤组织颜色多为黄色到黄绿色，质地较疏松（图1-E），且新陆早42愈伤组织较新陆早33生长快；CIM2培养基所诱导的愈伤组织颜色大多都呈绿色，有的出现白点，质地较硬（图1-F），且增殖速度较CIM1慢；CIM3培养基所诱导的愈伤组织颜色呈紫褐色，愈伤组织量少且质地紧密，但新陆早42愈伤组织较新陆早33多（图1-G）；添加IBA和KT的CIM4培养基所诱导的愈伤组织都有假根发生，而且愈伤组织颜色呈浅绿色,质地疏松，其中新陆早42有部分愈伤组织有胚胎发生，新陆早33则未发现胚胎发生（图1-H）。所产生愈伤组织按其颜色和质地可分为三类：一为颜色暗绿或深绿，部分间有白色霜状物，质地紧密坚硬的愈伤组织；二为颜色灰绿、浅绿到黄绿质地疏松无硬化的愈伤组织；三呈紫褐色，愈伤组织量少且质地紧密。

2.2愈伤组织的增殖及胚胎发生的诱导如上所述，棉花下胚轴产生的愈伤组织具有不同的颜色和质地，而这与再生能力有关。一般认为属于类型二的愈伤组织分化潜能较高，具有较强的再生能力；而类型一愈伤组织分化潜能低，较难以再生[14]；类型三基本褐化（图1-K），不能够生长。表3表明：IBA1.0mg•L-1+KT0.5mg•L-1培养基上新陆早42号在46d时就开始胚胎发生，不需要撤激素和附加硝酸钾的诱导（MS-BP），胚胎发生率为总愈伤数的（36.67±3.33）%；但新陆早33在此激素组合上不能直接胚胎发生。挑选类型二愈伤组织（未分化）继代于MSBP培养基上，每（30±2）d继代一次，观察增殖培养基上胚胎发生情况。继代培养1～2次后，可获得较为一致的质地疏松的愈伤组织（图1-I,L）CIM4上的新陆早42愈伤组织继代至MSBP培养基上1次就已胚胎发生，最早胚胎发生时间为继代后23d（图1-I）。CIM4上的新陆早33号愈伤组织继代至MSBP培养基上的胚胎发生时间较长，最早发现为继代后48d。而在2，4-D0.1mg•L-1+KT0.1mg•L-1生长的初生愈伤2个品种经继代到MSBF培养基上进行增殖和诱导才能胚胎发生，新陆早42和新陆早33胚胎发生的最早时间分别是71d和81d。即在这2种激素组合诱导下，新陆早42胚胎发生时间早于新陆早33，并且前者的胚胎发生率极显著高于后者。说明激素是诱导体细胞胚胎发生的关键，且不同基因型外植体对激素的要求也有所不同。同时，在MSBP培养基继代时，为防止愈伤组织的过度生长，仅接入黄豆粒大小的愈伤团，有利于胚胎发生。

2.3体细胞胚的成熟和植株再生选择新鲜、黄绿色、颗粒状的胚性愈伤组织至MSBF培养基继代1～2次后，愈伤疏松，米粒状，胚状体出现（图1-M）。其中，新陆早42在MSBF培养基上33d分化出肉眼可见的胚体，新陆早33在MSBF培养基上48d分化出肉眼可见的胚体。为促进体细胞胚的成熟可以在MSBF培养基上铺一层滤纸进行胁迫处理（图1-N）。在滤纸和透气膜的协同胁迫下,体细胞胚均发育良好,玻璃化、畸形苗等现象极少,产生了大量的子叶形胚。伸长的子叶胚(图1-O),继续培养于无滤纸的MSBF培养基上有利于获得发达的根系（图1-P）。待再生植株长至3～5片叶时,以嫁接的方法进行移植图（图1-Q）。直接在CIM4培养基上胚胎发生的新陆早42最早140d获得再生苗，而新陆早33最早210d获得再生苗。说明：新陆早42再生能力较新陆早33强。

3结论与讨论

4种激素组合的培养基均能诱导出愈伤组织，通过对新陆早42号和对照新陆早33号愈伤分化诱导情况来看，不同基因型对激素浓度以及激素组合的适应性有所不同。对照新陆早33号愈伤分化诱导在0.1mg•L-12，4-D和0.1mg•L-1KT组合下分化速度较快，并且经过MSBF培养基1～2次继代后就产生了胚性愈伤，这与刘丽等[7]研究结果一致。同时，其在1.0mg•L-1IBA和0.5mg•L-1KT组合下愈伤组织也能够分化，但愈伤分化率比2，4-D和KT组合低。而新陆早42号在1.0mg•L-1IBA和0.5mg•L-1KT组合下愈伤组织分化较快，46d愈伤组织胚胎发生，140d获得再生苗。表明不同基因类型外植体再生所需求的激素组合不同。Wu等[10]发现KT和IBA的激素组合对棉花愈伤组织和胚性愈伤组织的诱导都很有效，但胚性愈伤组织同时培养于有激素和无激素的相同培养基时，后者产生的球形胚数目显著高于前者。本研究发现，新陆早42能在含KT和IBA激素的培养基上胚胎发生，而新陆早33则不能胚胎发生。研究还发现，在继代过程中，在MSBP培养基上周期较长（40d）时，有利于愈伤组织的胚胎发生和胚状体的形成。本研究通过培养基上铺滤纸和用透气膜封口的方法，进行营养胁迫、干燥胁迫和增强透气性，以提高胚状体的再生率[15-17]。其结果不但缩短了再生时间，还降低了再生苗畸形率。经炼苗，采用嫁接的方法提高再生苗的成活率。本研究通过不同激素组合，首次建立了新陆早42号的胚胎再生体系。试验发现，新陆早42号能够在激素组合为1.0mg•L-1IBA和0.5mg•L-1KT组合的培养基上直接胚胎发生。新陆早42号再生体系的建立，对丰富棉花再生能力基因型，促进新疆棉花分子遗传育种，具有一定的意义。