高效液相色谱法测定人血浆中二甲双胍的含量

【摘要】 目的 建立测定人血浆中二甲双胍浓度的HPLC-UV方法。 方法 采用高氯酸直接沉淀，测定血浆中二甲双胍的浓度。 结果 血浆中杂质不干扰样品峰，1.25、0.125及0.025μg/ml的回收率分别为93.9%、92.6%及91.4%；1.250、0.25和0.025μg/ml的日内变异分别为：1.33%、4.08%及7.94%；日间变异分别为：4.56%、2.78%及2.19%；线性范围0.0125～2.50μg/ml，最低检测限0.0125μg/ml；血浆中二甲双胍冻融试验稳定。 结论 该方法稳定且精密度好，准确可靠，适用于二甲双胍血浆浓度测定。 【关键词】 二甲双胍；高效液相色谱法

二甲双胍（metformin）是双胍类口服降糖药，它主要作用于胰岛外组织，抑制肠吸收葡萄糖，增加外周组织对葡萄糖的利用，减少肝糖原异生，达到降血糖的目的，适合2型糖尿病患者。文献报道常用的检测方法是高效液相色谱法［1～3］，常用内标为阿替洛尔［1，3］。流动相常加入的离子对试剂，如十二烷基硫酸钠［1］、庚烷磺酸钠［2］和辛烷磺酸钠［4］。本文建立一种在流动相中加入十二烷基硫酸钠，采用高氯酸直接沉淀，测定其浓度的一种简易方法。

1 实验材料

1.1 试验药品及试剂 二甲双胍标准品：中国药品生物制品检定所提供。乙腈（色谱纯）：Fisher Company,Inc,USA;其余试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器 Shimadzu高效液相色谱仪：CBM-10A系统控制器；LC-10ATvp泵；DGU-12A除气机；CTO-10Avp柱温箱；SPD-12AV紫外检测器；Milli-Q Gradient A10超纯水器（Millipore Inc,USA)。

2 血浆中二甲双胍的HPLC法测定

2.1 色谱条件 流动相由水相（4mmol/L十二烷基硫酸钠，0.02mol/L NaH2PO4，0.5%三乙胺，用H3PO4调pH为4.0）-乙腈（74：26，v/v）组成，流速1.0ml/min；色谱柱为Discovery ODS 5.0μm 4.6×250mm I.D.;柱温箱温度40℃。

2.2 血浆样品的提取与分离 取血浆0.5ml，加入0.1ml 30%高氯酸，振荡1min，离心（18000r/m×10min),取20μl进样，用样品的峰面积进行定量分析。

2.3 方法的专属性 在本试验条件下，盐酸二甲双胍有较大的色谱峰和较好的分离度，血浆中杂质不干扰样品峰，基线噪音小（S／N＞3），盐酸二甲双胍的保留时间约为8.08min（见图1）。

2.4 血浆中二甲双胍标准工作曲线制备及其最低检测浓度测定 取空白血浆0.5ml，加不同量的标准品，使其浓度分别为0.0125、0.025、0.05、0.125、0.25、0.625、1.25和2.50μg/ml，按“血浆样品的提取与分离”项下操作，记录样品峰面积，利用样品浓度C对样品峰面积作直线回归，得回归方程A=54.608+47164 C，r=0.9999，（P<0.01,n=5）(见图2),线性范围0.0125～2.50μg/ml,最低检测浓度0.0125μg/ml。

2.5 回收率测定 取离心管数支，精密加入0.5ml超纯水，分别取盐酸二甲双胍标准液适量，配成含盐酸二甲双胍浓度分别为0.025、0.125和1.25μg/ml的溶液，按“血浆样品的提取与分离”项下操作，计峰面积As。另取离心管数支，加入0.5ml空白血浆，精密加入盐酸二甲双胍适量，配成0.025、0.125和1.25μg/ml的血浆，每种浓度各做5份样品。按“血浆样品的提取与分离”项下操作，计峰面积Ai，计算Ai与As的比值。结果高、中、低浓度的回收率分别为：93.9%，92.6%及91.4%。

2.6 方法的精密度试验 取空白血浆0.5ml，加入不同量的标准品，使其浓度分别为0.025、0.25和1.250μg/ml，按“血浆样品的提取与分离”项下操作，记录样品峰面积。测得日内变异和连续5天内的日间变异，高、中、低浓度的日内变异分别为：1.33%，4.08%及7.94%；日间变异分别为：2.19%，2.78%及4.56%。

2.7 冻融稳定性考查 取空白血浆0.5ml，加入不同量的标准品，使浓度分别为0.025、0.250和1.250μg/ml，放置-70℃冰箱冷藏1周后，测定血浆中药物浓度，高、中、低浓度的变异分别为：5.81%、2.97%及3.68%。

3 讨论

本研究建立的HPLC-UV法，灵敏度高、稳定性好、特异性高、干扰少（S/N>3）、样品处理简单、成本较低等特点。所得二甲双胍色谱峰形对称且无肩峰，采用峰面积对浓度回归，相关性较好。最低定量限为0.0125μg/ml,适用于二甲双胍血浆浓度测定。

【参考文献】

1 秦峰，雄志立，孙苏亚，等.盐酸二甲双胍片缓解片人体药代动力学及生物利用度.药物分析杂志，2005，25（3）：258-262.

2 厉伟兰,刘晓东,谢林,等.二甲双胍缓释片人体药代动力学及其相对生物利用度.江苏药学与临床研究,2006,14(2):4-7.

3 魏敏吉,吕媛,康子胜,等.复方盐酸二甲双胍片在健康人体的药代动力学和相对生物利用度.中国临床药理学杂志,2005,21(93):41-45.

4 赵春丽,刘建芳,胡玉钦,等.盐酸二甲双胍肠溶片的人体相对生物利用度.中国临床药学杂志,2004,13(1):25-27.