动物免疫血清的制备

[摘要]目的：探讨制备动物免疫血清的方法和效果，以适应其在实验教学中的需要。方法：制备好的免疫原，按照一定的免疫程序(免疫途径、次数、间隔时间、剂量)接种给所选择的动物。待动物体内产生抗体后，采集动物血液，分离血清对其效价进行测定。结果：经免疫后的抗血清最终分别达到1：2040以上的高效价。结论：此方法制备的抗血清效价高，特异性高，亲和力强，既经济又方便，适用于实验教学，提高了实验的开出率。

[关键词]免疫血清；免疫；免疫学试验；效价

[中图分类号]R392.7

[文献标识码]B

[文章编号]1674-4721(2009)12(b)-139-02

动物免疫血清的制备是一项常用的免疫学实验技术，广泛用于临床诊断、治疗和预防中，为教学、科研、检验之常用。在医学免疫学教学中，形象、直观、简易的直接凝集反应有助于学生了解抗原、抗体及抗原抗体间的免疫反应等抽象的概念，免疫血清的质量直接影响实验的特异性和敏感性。因此，制备高质量的免疫血清是建立高水平检测方法的前提条件。但免疫血清的制备较复杂，且需学生动手操作，用量较大，为达到这一目的，除了具备理想的免疫原外，还需要选择适宜的动物和设计有效可行的免疫程序或方案。通过多年的工作实践，笔者制备了高效价、高特异性、高亲和性的动物免疫血清，既经济又方便，供教学、科研所用，提高了实验的开出率。

1　方法与结果

1.1　动物的选择及饲养

制备抗血清的动物主要是哺乳类和禽类。羊、马、豚鼠、兔都是常用的动物，在实验中，选择动物时应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、要求以及动物个体等因素。因不同动物对同一抗原的敏感性不同，免疫时至少取用2只以上动物。选择制备免疫血清的动物必须是适龄、健壮、无感染的正常动物，体重最好在2～3 kg，年龄6个月以上，因雌性动物在性周期的不同阶段和怀孕、授乳时机体对抗原的敏感性有较大改变，所以一般挑取雄性动物。动物免疫后要认真做好动物的编号、标记、管理和记录，本实验用的动物是健康家兔。

1.2　抗原的制备

1.2.1　抗原稀释

用灭菌生理盐水将抗原稀释为2mg／ml，放置4℃过夜，次日取出，与佐剂混合制成乳剂后用于动物免疫。免疫原的注射剂量随抗原的性质有较大差异。一般考虑抗原的免疫原性的强弱、分子量大小、抗原的纯度、有无毒性及动物个体状态、免疫途径和时间、佐剂的使用与否等。对于纯的可溶性抗原，免疫时需与等量的弗氏完全佐剂混合，其免疫剂量以动物体重计算，一次注入的总剂量以0.5 mg／kg为宜。通常免为100～1000μg／次。另外免疫周期长者可少量多次注射，免疫周期短者可大量少次注射制备高度特异性的抗血清，选用低剂量抗原短程免疫法。

免疫周期随抗原和免疫方法的不同以及是否使用佐剂而变化。单次注射抗体产生缓慢，效价低，维持时间短，但抗体特异性高；多次注射无以上缺点，但抗体特异性有所降低，一般以3～4次较合适。注射间隔时间一般以1～2周为宜。间隔时间短，起不到再次免疫的作用；太长，则免疫过程延长，从而影响血清的特异性，如无佐剂时间隔2～4d，加用佐剂时可间隔10～30d。初次免疫与第二次免疫的间隔时间多为2～4周，此后，每次加强免疫的间隔时间为2～3周。

1.2.2　佐剂和抗原乳剂的配制

1.2.2.1　佐剂的配制。弗氏完全佐剂，各实验室的配方不尽相同，我室采用的配方如下：医用液体石腊20 ml与羊毛脂12g混匀加热溶化，分装于青霉素小瓶，用纱布、线绳扎紧瓶塞。高压灭菌，4℃保存备用。于免疫前准备抗原乳剂制备时，以活卡介苗代替死结核菌，每毫升试剂中加入10mg活卡介苗，即为弗氏完全佐剂。

1.2.2.2　抗原乳剂的制备。本实验选用注射器推注法：将抗原溶液和等量的完全佐剂(注意佐剂必须先加热融化。不超过50℃)分别吸入两个5 ml注射器内，在两个注射器的12号针头间用一根长约8-12 cm的医用无毒塑料管。将两个注射器连接在一起(塑料管必须浸泡消毒与注射器针头相连接)。针头塑料管1～2 cm然后两人相对而坐。缓缓推动针栓，使管内溶液进入塑料管道至对侧注射器内，每次必须把管内容物全部推出，另一侧同样操作，使管内液体往返混合直至形成油包水乳剂为止。

制成的乳剂是否形成油包水乳剂直接影响免疫效果，因此，必须进行质量检查。检查的方法：将制成的乳剂滴在凉的自来水表面，质量合格的乳剂滴入水面保持乳滴珠完整而不分散；如进入水面后立即扩散，水面油花逐渐扩大即不合格，应继续乳化至合格为止。

1.3　免疫途径、注射时间、部位及剂量

不同的免疫途径，抗原在体内的的代谢速度不同，对免疫系统的刺激强弱也就不同，因而产生抗体的水平也就不同。抗原的注射途径可根据免疫动物个体的大小、抗原及抗体制备目的或要求不同，选用皮内、皮下、肌肉、静脉或腹腔等不同途径免疫。本实验对家兔使用皮内和皮下多点注射。第1周在足、掌皮内注射含佐剂抗原0.1ml，第2周在腹部皮下注射含佐剂抗原0.5 ml，第3周在腹部皮下注射不含佐剂抗原0.5 ml，第4周在腹部皮下注射不含佐剂抗原0.5 ml。

1.4　试血及测定抗体效价

末次注射10 d后于耳静脉采血2 ml，分离血清进行试血。笔者选用免疫双扩散法在56℃条件下加热30 min灭活补体。在琼脂板中间孔加稀释的抗原10μl( mg／ml)，周围孔依顺时针方向，分别加入用生理盐水或PBS按1：2，1：4，1：8，1：16，1：32和1：64的比例稀释的动物免疫血清。经37℃保温24 h后观察结果，效价在1：16以上即可决定采血。选用环状沉淀试验将一定浓度的抗原200μl加入到环状沉淀管中，然后在抗原液面上加入稀释的免疫血清，如在20 min内，抗原与血清的交界面能出现“++”的沉淀环，以沉淀环的直径、大小来判断效价的高低。一般效价高达1：2040以上才可放血。

1.5　取血、分离、分装及保存

免疫动物经效价检测合格后即可考虑取血。为减少血清中的脂肪含量，放血前可考虑停食12 h。本实验采用心脏穿刺取血，无菌技术进行操作，动物于仰卧位固定，用食指探明心脏博动量高部位，剪去少许毛。用2.5％碘酒和75％酒精消毒后，以9号针头在预定位置与胸部呈45。角刺入心脏，微微上下移动针头，待血液进入针筒后，即将注射器位置固定取血。2.5kg体重的家兔一次可取血20～30ml。取血后由静脉缓缓注入等量5％葡萄糖液以补足失血量。取血的兔子经2～3个月休息。可再次加强免疫后取血。

1.6　分离血清及免疫血清的保存

无菌条件下将平皿或三角瓶内的血液凝固血块收缩后，用无菌滴管吸取血清，于3 000 rpm离心15 min。取上清液。合格后的抗血清以1：100比例加入1％的硫柳汞或5％的叠氮钠，最后浓度分别为0.01％或0.05％，用无菌滴管将抗血清分装小管，每管装1ml左右。-20℃以下保存，可保存2年以上。如有条件可将血清冷冻干燥保存于4℃以下冰箱。保存时间更久。

2　讨论

此方法简单易行，速度快，效果好，所获的抗体效价高，特异性高，亲和力强。通过本次实验的设计及实验过程和结果来看，整个实验过程的操作简单易行，效果高，更重要的是本实验包含了抗原的制备、免疫动物、抗血清的采集、抗体的鉴定、分离提纯、抗体的效价检测等内容。是一项综合性系统性实验，是免疫学及免疫学技术的浓缩。该实验既提高了学生的理论水平，又培养了学生运用理论指导实践，在实践过程中发现问题、分析问题和解决问题的能力。因此，笔者认为这种系统性实验适合免疫学实验教学。