饮食和运动干预对高脂饮食性肥胖大鼠心肌间质胶原纤维的影响

摘 要： 目的：研究饮食和运动干预对肥胖大鼠心肌间质胶原纤维的影响并对其可能的机制 进行探讨。方法：将三周龄SD大鼠随机分为正常组和高脂饮食组，肥胖大鼠再分为肥胖对 照组、饮食干预组与运动和饮食联合干预组，第16周时处死。用逆转录聚合酶链式反应(RT- PCR)法测定心肌ACEmRNA 表达；羟脯氨酸法测定心肌胶原含量；采用双抗体夹心法ABC―ELI SA测定血清PICP、PIHNP；苦味酸―天狼星红胶原染色大鼠心脏切片；免疫组化法测定心肌A T1受体和CTGF的表达。结果：肥胖大鼠存在严重的血脂紊乱，心肌胶原含量显著增加，血清 1型前胶原羧基端肽、心肌组织ACEmRNA 和AT1R、CTGF蛋白表达增加。饮食干预组血脂紊乱 程度减轻，心肌胶原含量、血清1型前胶原羧基端肽、ACEmRNA 和AT1R、CTGF表达均有降低 、Ⅲ型前胶原氨基端肽表达有所升高；运动和饮食联合干预组体重下降明显，心肌胶原含量 、血清1型前胶原羧基端肽、ACEmRNA 和AT1R、CTGF表达下降更明显、Ⅲ型前胶原氨基端肽 表达升高显著。结论：高脂性肥胖大鼠存在心肌间质胶原纤维化，并与ACEmRNA 和AT1R、CT GF、血清1型前胶原羧基端肽表达的改变有关系。单纯性饮食疗法能够减缓心肌纤维化的进 展，饮食和运动联合干预能够使心肌纤维化早期良性逆转。

关键词：干预性研究；肥胖；心肌重构；大鼠

中图分类号：G804.2文献标识码：A文章编 号：1007-3612(2011)03-0059-05

Influence and Possible Mechanism Analysis on Myocardial Intersti tium Remodeling of

High lipid Diet Rats in Diet and Exercise Intervention

LI Gang

(Huaiyin Normal University， Huaian 223001， Jiangsu China)

Abstract: Objective: The purpose of this study is to probe into the influence of diet andexercise training on myocardial interstitium remodeling in high lipid diet ratsand discuss possible mechanism. Methods: SD rats (three weeks old) were divide d into the normal group and the high lipid diet group randomly.Then fat rats w ere divided into three gro ups randomly， namely obese control group， diet intervention group， diet comb ined with exercise intervention groups. The fat rats were sacrificed at the endof 16th week. Myocardial ACEmRNA expression was determined by reverse transcri ptase polymerase chain reaction (RT PCR)； Myocardial collagen content was meas ured by biochemical method； Collagen of the heart was stained by picric acid s irius red；Myocardial AT1 receptor was determined by immunohistochemical method .Result:Lipids disorder and myocardial collagen content increase.And ACEmRNAand AT1R expression growth happened in rats of obese control group.For rats ofdiet intervention group，the degree of lipids disorder alleviated.At the sametime，myocardial collagen content， expression of ACEmRNA and AT1R reduced in ra ts of diet intervention group. The weight of rats in diet combined with exercis e intervention groups declined obviously. Myocardial collagen content， express ion of ACEmRNA and AT1R reduced more distinctly. Conclusion: myocardial interst itium remodeling happened in high lipid diet rats， in connection with change o f ACEmRNA and AT1R expression. Single diet intervention can slower the developm ent， diet combined with exercise intervention can reverse benignly myocardial i nterstitium remodeling in early time.

Key words: intervention research； fat； myocardial remodeling； rats

随着生活水平的日益提高，肥胖(Obesity)在全球的发病率正在逐年上升。肥胖是Ⅱ型糖尿 病、高血压、高血脂、冠心病等疾病的主要危险因素，已成为威胁人类健康的常见疾病 ［1］。研究表明，许多肥胖患者存在着心脏结构和功能的改变，比如心室肥厚、心 腔变小、心功能下降等［2］。本实验通过高脂饮食喂养建立肥胖大鼠模型，并进行 饮食和运动干预，观察心肌间质胶原纤维、羟脯氨酸含量、胶原含量、血清PICP、PIHNP、A CEmRNA 和AT1、CTGF表达的变化，探

析饮食和运动治疗对肥胖大鼠心肌间质胶原纤维化的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物与分组 将44只3周龄SD健康雄性大鼠（新疆医科大学提供）随机分为2组：正 常组8只，断乳后给予普通饲料喂养，在第8周时选取体重超出正常对照组平均体重20%的大 鼠24只，然后再随机分为肥胖对照组、饮食干预组和饮食与运动联合干预组3组，其中饮食 干预组继续给予高脂饲料喂养，饮食和运动联合干预组改为普通饲料喂养，并且每天采用无 负重游泳运动1 h，每周5 d。所有大鼠都在实验后第16周时处死。

普通饲料为常规配方。高脂肪饲料的配制方法如下：每100 g普通饲料加全脂奶粉15 g， 猪油5 g，鱼肝油10滴，黄肚豆15 g，鸡蛋黄50 g，牛胆酸纳0.5 g［3］。均有新疆 医科大学医学院实验动物中心提供。大鼠自由饮食摄食，自然昼夜采光。

1.2 标本的采集 将大鼠称重后，并隔夜禁食后，麻醉，剖腹， 下腔静脉取血，离心，取血清放置在-80℃冰箱保存待测。开胸取出心脏后，剪去大血 管，冰冷生理盐水冲洗，滤纸吸干水分，称重，计算心脏重量指数［心脏重量(g)／体重(g) ×1 000］；留取部分心肌置于-80℃冰箱保存。

1.3 血脂的测定静脉血自凝血离心后取上清，应用全自动生化分析仪测定总胆固醇（CHOL ）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、甘油三酯（TG）、极低密度脂蛋白和游 离脂肪酸。

1.4 心肌胶原含量的测定方法采用南京建成生物工程研究所所提够的羟脯氨酸测试盒（样本碱水解法）测心肌组织羟脯氨 酸含量。心肌胶原含量=羟脯氨酸/13.4%（mg/g心肌）。

1.5 血清PICP、PHINP的测定 血清P I CP、PIHNP测定采用双抗 体夹心法ABC-ELISA法。

1.6 心肌胶原纤维形态学观察及半定量分析经固定后的心肌组织，经过石蜡包埋，制片后，切片约5 μm。常规脱蜡，0.1%饱和苦味 酸天狼星红染色1 h之后，脱水、透明，最后用中性树胶封片。把制备好的切片用医学图 像分析系统进行半定量分析：随机取4个视野，在高倍镜下测量心室心肌胶原面积和统计场 面积，用“心肌胶原容积分数=心室心肌胶原面积/统计场面积，血管周围胶原面积=小动脉 管腔周围胶原面积／管腔面积”来表示心室心肌胶原纤维分布情况。

1.7 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法测定心肌ACE2mRNA表达

1.7.1 总RNA的提取 总RNA的提取参照Trizol RNA提取试剂说 明书的流程提取组织总RNA，包括组织匀浆的处理，分离，RNA的沉淀，RNA的清洗，RNA的再 溶解，最后把样品在-70℃冷冻保存。

1.7.2 cDNA合成以及PCR的扩增 按照Promega公司M―MuLV Rev erse Transcriptase的说明书进行。

1.7.3 引物设计与合成 从NCBI的nucleotide里面查得目的基 因和内参照基因，由上海博 亚生物技术有限公司设计上下游引物。引物序列如下：ACE2下游序列：5’TGC TCT TGC CATCTC ATT TT 3’，ACE2上游序列：5’AAC ACC AAC ATT ACG GAG GAG 3’，扩增片断长429 bP。β－actin下游序列：5’TAG GAG CCA GGG CAG TAA 3’，β－actin上游序列：5’GAAATC GTG CGT GAC ATT A 3’，扩增片断长349 bP。退火温度均为55.4℃。

1.7.4 PCR扩增产物半定量分析PCR扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统(美国 BIO-RAD公司)扫描采图，用Quantity-one软件进行图像分析和半定量分析，结果以特异的D NA条带的灰度值与内参β－actin的DNA条带的灰度值之比表示。

1.8 心肌组织AT1R蛋白表达的检测采用免疫组化SABC法，DAB棕黄色反应呈色，按照试剂 盒说明依次切片脱蜡和水化、抗原修复、滴加一抗、二抗，最后二甲苯透明，中性树胶封片 。显微镜下观察AT1R阳性呈现棕黄色，应用计算机病理图文分析系统（成都金盘病理多媒体 图文分析系统）进行AT1R相对含量分析。每张切片采用计算机图像分析系统随机选取十个高 倍视野（X400），选棕黄色阳性区域，以阳性染色区域的面积比表示该切片心肌组织中AT1R 含量，再以同一标本的6张AT1R染色切片的心肌组织中AT1R含量的平均值代表该标本心肌组 织中AT1R的表达量。

1.9 统计学方法 采用SPSS 10.0软件分析，全部数据均以 均数X±SD表示，各组间均数比较采用单因素方差分析，P

2 结 果

2.1 血脂的改变通过与正常组对比，肥胖大鼠CHOL、TG、LDL、VLDL显著升高，HDL显著降 低；饮食干预组和饮食与运动联合干预组的上述指标显著的改善，除了CHOL仍明显高于正常 组而外，其余指标接近于正常，并且两组之间差异具有显著性。联合干预组大鼠TG明显低于 肥胖对照组(表1)。

2.2 体重、心脏重量及心脏重量指数的比较与正常对照组比较，肥胖大鼠体重、心重明显 增加，心脏重量指数五无显著的变化；饮食干预组大鼠体重、心重显著低于肥胖对照组；联 合干预组体重下降更明显，而心脏重量高于正常组和肥胖对照组，心脏重量指数明显高于其 他各组（表2）。

2.3 心肌胶原含量的变化与正常组相比，肥胖对照组大鼠的心肌胶原含量显著增加，在饮 食干预组轻度下降，联合干预组下降明显，但与正常组比较，饮食干预组差异没有统计学意 义（表3）。

2.4 血清PICP、PHINP的变化与正常组相比，肥胖组大鼠血清PICP显著升高，PHINP表达降 低，PICP/PHINP显著升高；在饮食干预组大鼠血清PICP有所降低，PHINP表达升高，PICP/PH INP升高，但差异不显著；联合干预组大鼠血清PICP下降明显，PHINP表达显著升高，PICP/P HINP显著降低（表4）。

2.5 心肌间质胶原纤维的变化 通过与正常对照组相比，肥胖 组大鼠心肌间质胶原纤维明显增多，且血管周围有大量胶原沉积，饮食干预组和饮食与运动 联合干预组明显降低，其中联合干预组下降最显著（图1，表3）。

图1示：饱和苦味酸―天狼猩红染色法使心肌胶原特殊染色，组织呈黄色，胶原呈红色。（ 图A E正常对照组大鼠心肌胶原特异染色，可见有少量的胶原沉积，血管周围有少量胶原沉 积，200X；图BH 联合干预组大鼠心肌胶原显著降低，200X；图D F 肥胖组大鼠心肌胶原显 著增多且增粗，血管周围有较多的胶原沉积，200X；图C G 饮食干预组大鼠心肌胶原和血管 周围胶原，200X；）

2.6 心肌组织AT1R、CTGF蛋白表达与安静对照组相比，肥胖组大鼠AT1R、CTGF蛋白表达 明 显增高，可见到大量的阳性细胞表达，饮食干预组和饮食与运动联合干预组AT1R、CTGF蛋白 明显降低，其中联合干预组下降显著（图2，表5）。

图2示：免疫组化染色后各组大鼠心肌AT1R、CTGF的表达，其中阳性细胞呈棕黄色（图J N正 常对照组大鼠心肌AT1R、CTGF有较少的表达，200X；图B V 饮食干预组大鼠心肌AT1R、CTGF 的表达下降明显，200X；图CU 联合干预组大鼠心肌AT1R、CTGF的表达显著降低，200X；图DM 肥胖组大鼠心肌AT1R、CTGF大量表达，200X；）

2.7 心肌ACEmRNA的表达与正常对照组相比，肥胖大鼠ACE2mRNA表达明显增高，灰度值明显 高于对照组，饮食干预组和联合干预组大鼠下降显著，其中联合干预组下降明显（图3 表5 ）。

图3示：以100 bpDNALadder的Marker为标志，与441 bp，349 bp处可见到扩增产物条带，心 肌ACE基因及其β-actin内参基因片段。各基因的RT-PCR产物电泳条带的位置与理论值是一 致的。

和安静对照组比较，肥胖组心脏ACEmRNA的表达显著升高（p

3 讨 论

心肌纤维化是指在心肌的正常组织结构中胶原纤维过量积聚、心脏组织中胶原浓度显著升高 或胶原成分发生改变。其与心律失常、心功能障碍甚至心脏性猝死密切相关［4］。 表现 为心肌细胞肥大、增生，凋亡与胚胎基因再表达和心肌细胞外基质（extracellular matrix ,ECM）改变［5］。ECM主要由胶原蛋白、弹性蛋白、纤黏蛋白、层粘蛋白、蛋白聚糖 等五大类 物质组成。胶原在心脏ECM中含量最丰富，心肌的胶原网络对心肌细胞的效能甚至心脏的功 能都起着重要的作用［6］。心肌胶原网络的重塑在大多数心血管疾病的心脏间质 重塑过 程中具有重要的意义。目前关于单纯性肥胖所致心脏结构改变的研究很少涉及间质结构。

本实验通过对高脂膳食喂养SD大鼠建立肥胖动物模型，发现肥胖大鼠不仅存在严重的 血脂紊乱，同时发现心肌胶原容积分数显著升高，胶原含量显著增加，存在心肌纤维化现象 。

心脏的收缩功能取决于心肌组织的弹性，即心室的僵硬度，而心室的僵硬度又主要取决 于1、Ⅲ型胶原的比例，1型增加可使心肌僵硬，而Ⅲ 型明显增加可使心室的顺应性增加， 二者的比值可反映心肌纤维化的程度，二者比例失调，使心脏易发生室性心律失常进而影响 心功能［7］。I型和Ⅲ型胶原形成前裂解的羧基和氨基末端分别形成两个前多肽前胶 原羧基端 肽(cP)和前胶原氨基端肽(NP)，因此血清中I型前胶原羧基端肽(PI CP)或IIl型前胶原氨基 端肽(PIIINP)浓度升高表明I型或IⅡ型胶原合成增加［8］。本实验研究结果发现， 肥胖组大 鼠血清PICP显著升高，PHINP表达降低，PICP/PHINP显著升高；在饮食干预组大鼠血清PICP 有所降低，PHINP表达升高，PICP/PHINP升高，但差异不显著；联合干预组大鼠血清PICP下 降明显，PHINP表达显著升高，PICP/PHINP显著降低，表明了肥胖大鼠存在心室顺应性下降 ，僵硬度提高，提示肥胖大鼠存在心功能降低的现象。

通过控制食谱、控制食谱联合有氧运动对高脂饮食性肥胖大鼠进行干预，发现大鼠血脂 紊乱程度显著下降、心脏组织中胶原沉积下降，胶原容积分数降低，其中饮食干预联合游泳 运动则使体重下降更明显，接近于正常，而心脏重量增加，心脏重量指数升高，心肌胶原含 量、心肌胶原容积分数轻微下降，提示控制饮食和有氧运动是治疗单纯性肥胖的主要措施。

在生理状态下，ECM 的合成与降解处于动态平衡。一旦平衡失调，降解减少和(或)合 成增多则可导致心肌间质胶原蓄积［7］。而胶原的生成和降解之间的动态平衡涉及 一系列的 调控因素，其中ACE的活性、AT1R表达是细胞外间质的重要调节因子。ACE是RAS中的一个限 速酶，不但可以促进血管紧张素Ⅱ的生成，还可以抑制缓激肽及血管紧张素［1-6］的分解，在RAAS中具有十分重要的作用［9］。于学军等研究发现SHR心肌心肌组织内 A CE活性明显升高，且与代表心肌间质纤维化的参数同步变化［9］。进一步的研究发 现，利用ACE抑制剂西拉普利抑制ACE的活性后，代表左心室心肌肥厚及心肌纤维化的指标的 参数恢复至对照组水平，提示心肌间质纤维化的发生可能与ACE的增生有关［10］。A ngII是RAAS重要效应因子 ，而AngⅡ主要与其受体结合发挥作用，其大部分作用如：收缩血管，升高血压，促进醛固 酮、抗利尿激素、内皮素等的合成和释放，刺激交感神经，促进心肌肥大、间质增生，刺激 血管平滑肌细胞增殖和迁移，诱导纤维化等是通过AT1介导已被广泛认可［11］。 既往已通过左室肥厚模型观察到在左室肥厚过程中AT1R表达增高促进心肌细胞肥大增殖［12］。P aradis等研究发现，AT1受体过度表达的转基因大鼠可发生心肌重构,提示AngⅡ通过AT1受体 可直接诱导心肌重构的发生［13］。CTGF是多种组织、器官纤维化形成过程中的重要 介质，它对成纤维细胞及肾细胞的分化、增值及细胞外基质的合成和降解具有很强的调控作 用［14］。 临床研究表明，采用抑制剂抑制AT1R的表达后，CTGF的生成明显减少，提示AngII通过AT1R 介导机制调节心肌成纤维细胞中CTGF的形成［15］。

本实验研究结果显示，肥胖组大鼠ACEmRNA、AT1R、CTGF的表达均高于正常对照组，提 示肥胖大鼠心肌组织中ACEmRNA、AT1R、CTGF的高表达可能是肥胖大鼠心肌中胶原过度沉积 的原因之一，而饮食干预组大鼠和联合干预组大鼠的ACEmRNA、AT1R、CTGF的表达明显低于 对照组，提示饮食干预和运动联合干预在一定程度上通过下调大鼠心肌组织中ACEmRNA、AT1 R、CTGF的表达来抑制心肌胶原的增生。

同时发现， CTGF的表达随着AT1R表达的变化而变化，表明对于心肌成纤维细胞，CTGF可能是AngII一些生物学的下游效应因子，AngII促进心肌间质胶原纤维的改变可能部分 是经CTGF途径的，AngII通过AT1R介导机制调节心肌成纤维细胞中CTGF的形成，从而进一步 影响心肌间质胶原纤维的发生发展。

以上研究结果表明，单纯限制高脂摄入可以减缓肥胖大鼠的肥胖进展，进而减轻其对 心脏的影响。饮食和运动联合干预则更进一步的减轻大鼠的肥胖度。然而，这一改变与肥胖 所致的心室肥大有明显的不同：肥胖使心肌细胞和间质胶原不成比例增长，造成胶原纤维过 度增生，增加心肌僵硬度，降低心肌顺应性，导致心肌舒张功能的障碍；而运动则会使心肌 细胞和间质胶原协调增长，使心肌结构朝着增加能量供应以及收缩能力储备的方向发展，心 脏的舒缩功能更进一步提高，在更大的程度上满足了机体的需要，为适应性心肌肥厚［ 15，16］。饮食和运动联合干预以后大鼠心肌胶原含量并没有显著变化，说明心肌间质胶 原增 多并未引起过多聚积造成心肌间质纤维化，其增加与心肌细胞运动性肥大相一致。

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