黄芪多糖改善老年大鼠的学习记忆水平及其机制研究

[摘要] 该研究通过观察黄芪多糖对老年大鼠学习记忆的影响，试探究其改善学习记忆能力的机制。实验以自然衰老雌性SD大鼠为动物模型，随机分为老年对照组、老年黄芪多糖低、高剂量组（50，150 mg・kg-1）和老年脑复康组（阳性对照，560 mg・kg-1），各组大鼠连续灌胃给药60 d，另设青年对照组。采用旷场和Morris水迷宫测试大鼠的学习记忆能力，蛋白免疫印迹法观察海马组织相关神经可塑性蛋白N-甲基-D-天门冬氨酸受体（NMDA受体）、钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）、蛋白激酶A（PKA）、cAMP反应元件结合蛋白（CREB）的磷酸化水平及脑源性神经营养调控因子（BDNF）的蛋白表达水平。研究发现与青年对照组比较，老年大鼠学习和记忆能力均显著下降（P

[关键词] 老年大鼠；黄芪多糖；神经可塑性

[收稿日期] 2013-11-14

[基金项目] 中国科学院知识创新方向性项目（KSCX2-YW-R-254）；浙江省中西医结合老年医学重点学科项目

[通信作者] 郭建友，博士，研究员，Tel /Fax：（010）64852787，E-mail：

[作者简介] 姚惠，副主任中医师，Tel：18072968779，E-mail：

目前我国60岁以上老年人口已经超过总人口的10%，人口年龄结构开始进入老龄化阶段。伴随着年龄增长常出现脑机能退化和神经退行性病变，引起常见的认知功能障碍包括学习能力下降及迟发记忆障碍。现有的治疗老年性痴呆药物如胆碱酯酶抑制剂能够短期治疗记忆功能缺失，但是并不能阻止神经退行性变[1]。因此，寻找能够阻止或延缓年龄增长导致的记忆减退，促进健康老龄化进程的药物显得非常重要[2]。黄芪是一味药用历史悠久、临床应用广泛的传统补益类中药。黄芪及其提取物的抗衰老药理作用已经为临床实践所证实，其中黄芪多糖（Astragali Radix polycose，APS）是从黄芪中分离提纯的主要有效成分，具有提高免疫、抗氧化等作用。已有研究表明黄芪多糖能够降低老年小鼠的自由基水平，对衰老成纤维细胞具有保护作用[3]。但黄芪多糖是否能够阻止或者延缓年龄增长导致的记忆减退等症状，目前并没有相关的文献报道。

由于缺乏较公认的衰老及老年痴呆动物模型，抗衰老药物的发展缓慢。其中自然衰老动物是最接近人类衰老变化的动物模型[4-5]。另一方面，女性比男性更容易出现认知功能障碍，年龄超过65岁的女性更早出现神经退行性病变且发病进程更快，女性的发病率也是男性的2～3倍[6-7]。因此在本研究中，选用雌性老年大鼠作为衰老动物模型，考察黄芪多糖对老年大鼠的学习记忆能力的影响。由于神经元的突触可塑性与学习和记忆密切相关，通过测定大鼠海马中神经可塑性相关蛋白表达水平探讨黄芪多糖抗衰老的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 雌性老年Sprague-Dawley（SD）大鼠48只，清洁级，20～22月龄，体重360～420 g；雌性SD青年大鼠12只，4月龄，体重200～220 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。适应性饲养7 d后进行实验，动物自由摄水，室温控制23～25 ℃，湿度为50%～70%，光照12 h，黑暗12 h。

1.2 药品 黄芪多糖购自西安鸿生生物技术有限公司，纯度95%，以生理盐水配成0.1 g・mL-1；阳性对照药物为脑复康（piracetam），购自北京市曙光制药厂，以生理盐水溶解配成0.056 g・mL-1。

1.3 试剂及仪器 总蛋白提取试剂盒（普利莱基因技术有限公司）；p-NMDAR和t-NMDAR1抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；p-CaMKⅡ，t-CaMKⅡ，p-PKACβ，t-PKACβ，p-CREB，t-CREB，BDNF，β-actin抗体（美国Sant Cruz公司）；ECL发光底物显色试剂盒（美国Pierce公司）；IgG-HRP二抗（北京中杉公司）；其他化学试剂均为国产分析纯。旷场测试系统（美国Med Associates公司）；Morris水迷宫系统（中国医学科学院药物研究所）；高速冷冻离心机（Beckman Allegra 64R）；UV-2800紫外分光光度计（龙尼柯上海仪器有限公司）；垂直板电泳转移装置（美国Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 动物分组及给药 48只SD老年大鼠随机分为4组，每组12只。老年大鼠（模型）组，不给药，灌胃生理盐水；阳性药物对照组灌胃脑复康， 剂量为560 mg・kg-1・d-1；黄芪多糖高、低剂量组灌胃黄芪多糖，剂量分别为150，50 mg・kg-1・d-1。同时将青年SD大鼠12只设为青年对照组，灌胃生理盐水。各药物组按照剂量配成混浮液，连续灌胃给药60 d，每天1次。

2.2 行为学测试 各组大鼠给药60 d后，进行旷场及Morris水迷宫测试。在Morris水迷宫正式测试前进行5 d训练，在训练过程中仍继续给药，测定各组动物在水中寻找平台的时间和路线。各组动物最后1 d给药后先进行旷场实验，随后进行Morris水迷宫测试。

2.3 旷场实验（open-field test） 实验装置为100 cm×100 cm×50 cm，四周底面全部涂黑的无盖圆筒。实验前让大鼠自由探究5 min。正式实验时，将大鼠放入旷场的边缘区，采用视频跟踪分析系统自动记录大鼠5 min的活动情况。观察大鼠的运动距离和进入旷场中央（半径33 cm的圆形区域）的时间百分比。

2.4 Morris水迷宫测试 Morris水迷宫是直径120 cm，水深50 cm的圆形铁皮水池，水温控制在（24±1） ℃左右。池壁上有东、南、西、北4个入水点，其南北、东西的连线将水池划分为4个象限，分别称第1象限（SE）、第2象限（NE）、第3象限（NW）、第4象限（SW），在第4象限正中离池壁24 cm处放与水池背景同色的平台，平台低于水面3 cm。训练前1 d将大鼠放入无站台的池中自由游泳，以适应环境和剔除漂浮且停留的大鼠。①定位航行实验测试：将大鼠面向池壁放入水中，从入水到找到隐蔽平台的时间记为潜伏期，若找不到平台则引导大鼠至平台停留数秒并记潜伏期为60 s，每天分别从4个象限将大鼠放入水中训练并记录，历时5 d。每天训练取当天平均潜伏期作为成绩，游泳的轨迹为总路程，取平均值作为成绩。②空间探索实验：第6天游泳测试撤去平台，记录大鼠在60 s内穿越原平台位置的次数，以及在原平台所在象限的停留时间，检测大鼠对原平台的空间记忆情况。

2.5 神经可塑性相关蛋白测定 行为学实验结束后，立即断头，在冰上取海马组织，置-80 ℃保存备用。大鼠海马组织总蛋白提取按总蛋白提取试剂盒说明书操作，并用考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白浓度。取总蛋白（50 μg） 在SDS-PAGE 凝胶上电泳分离2 h，将凝胶湿转至PVDF膜。取出PVDF膜，浸于封闭液中室温轻摇封闭1 h，用TBST缓冲液漂洗干净，浸入TBST稀释的一抗， 室温下孵育1～2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗2次，每次10 min；再用TBS洗1次，10 min。同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗2次，每次10 min；再用TBS洗1次，10 min。之后用ECL检测试剂盒显色，曝光、显影和定影，将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的相对分子质量和净吸光度值。

2.6 统计学分析 用SPSS 16.0软件对数据进行统计，结果以±s表示。实验结果先用单因素方差分析（ANOVA），差异显著性再用Dennett′s t检验进行组间统计分析。

3 结果

3.1 黄芪多糖对老年大鼠旷场实验的影响 与青年大鼠相比，老年大鼠组运动总距离显著降低（P

3.2 黄芪多糖对老年大鼠逃避潜伏期的影响 老年组大鼠逃避潜伏期与青年组相比在第1天和第2天的测试均明显延长（P

3.3 黄芪多糖对老年大鼠空间探索试验的影响 与青年大鼠比较，老年组大鼠逃避潜伏期空间探索试验的原平台穿越次数显著下降（P

在原平台所在象限停留时间较模型组明显下降（P

3.4 黄芪多糖对老年大鼠神经可塑性相关蛋白的影响 与青年对照组比较，老年大鼠海马组织p-NMDAR1，p-CaMKⅡ，p-PKACβ，p-CREB的磷酸化蛋白表达水平显著下降（P

4 讨论

本研究结果表明老年SD大鼠学习和记忆能力显著下降，表现在Morris水迷宫测试的定位航行试验逃避潜伏期延长，空间探索试验中穿越原平台位置的次数以及在原平台所在象限的停留时间下降。黄芪多糖给予60 d干预后能显著改善老年大鼠的学习记忆减退现象。黄芪多糖不影响老年大鼠旷场测试的活动距离及中间区时间百分比，表明黄芪多糖并不是通过影响老年大鼠的活动性能而使Morris水迷宫结果产生差异。

关于学习记忆退化的机制是近年来的研究热点，其中涉及相关受体、神经递质、蛋白激酶等多种信号转导级联反应过程。学习、记忆的形成过程及脑功能的可塑性变化，如长时程增强（LTP），与N-甲基-D-天门冬氨酸受体（NMDA受体）和钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）的磷酸化状态密切相关[1]。NMDA受体1（NMDAR1）是NMDA发挥功能所必须的受体亚型。CaMKⅡ是蛋白突触后致密物的主要蛋白（PSD），它类似于一个“分子开关”，通过自身磷酸化过程决定将短期记忆转化为长期记忆信息存储[8]。蛋白激酶A（PKA）信号途径尤其PKACβ是调控重要学习和记忆过程的分子元件[9]。此外，cAMP反应元件结合蛋白（CREB）是启动转录激活其他基因编码蛋白质的关键蛋白，在信息存储相关蛋白的结构和功能改变中发挥重要作用[10]。许多基因与cAMP反应元件（CRE）在其启动子区域序列，特别重要的是脑源性神经营养因子（BDNF）。BDNF通过转录和转录后机制调节蛋白质合成，并且可能通过在突触位置持续，再生信号激活释放和合成CaMKⅡ[11]。因此，本研究测定上述神经可塑性相关蛋白的表达水平作为黄芪多糖改善老年大鼠学习记忆的主要指标。

海马是哺乳动物空间学习、记忆形成的重要结构功能区，也是神经可塑性改变的主要脑区[12]。在衰老过程中海马神经元的易损性是学习记忆退化的重要原因，成年人的海马神经发生随着年龄增长而迅速下降[13]。本实验选择的蛋白与神经可塑性密切相关。实验结果表明，老年大鼠p-NMDAR1，p-CAMKⅡ，p-KAC，p-CREB以及BNDF等蛋白相对表达较青年组显著下降。这些神经可塑性相关蛋白水平的下降，可能与记忆相关的任务密切相关。结果提示海马相应神经可塑性蛋白水平的下降影响其学习记忆功能，推测这可能是导致增龄性学习记忆减退的重要原因之一。经黄芪多糖干预后，这些神经可塑性蛋白的表达水平显著上升。

目前临床上缺乏有效的抗衰老的药物，现有药物多只能对症治疗。中医药治疗的优势之一在于全面动员自身的调理功能，偏重于促进神经元自身的结构和功能变化。中药在缓解衰老及衰老相关疾病的防治方面有着丰富的理论和实践经验。目前中药单体及有效成分缓解衰老的研究进展较快[14-17]，其中研究较多的有人参皂苷、灵芝多糖等[18-20]，这些实验为寻找抗衰老药物提供了很好的思路和方法。本研究通过研究黄芪多糖对神经可塑性蛋白的影响，探讨了黄芪多糖对老年大鼠的学习记忆的保护作用。上调神经可塑性相关蛋白水平可能是黄芪多糖改善老年大鼠学习记忆能力的主要机制，其具体的信号转导通路及作用点仍需进一步的研究。

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Study on effect of Astragali Radix polysaccharides in improving learning and

memory functions in aged rats and its mechanism

YAO Hui， GU Li-jia， GUO Jian-you

（1. Department of Internal Medicine of Traditional Chinese Medicine， Zhejiang Hospital， Hangzhou 310013， China；

2. Key Laboratory of Mental Health， Institute of Psychology， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100101， China）

[Abstract] To observe the effect of Astragali Radix polysaccharides （APS） on the learning and memory functions of aged rats， in order to explore its mechanism for improving the learning and memory functions. Natural aging female SD rats were selected in the animal model and randomly divided into the control group， the APS low-dose group （50 mg・kg-1）， the APS high-dose group （150 mg・kg-1） and the piracetam-treated group （560 mg・kg-1）. They were orally administered with the corresponding drugs for consecutively 60 days. Besides， a young control group was set. The learning and memory functions of the rats were tested by the open-field test and the Morris water maze task. The Western-blot method was used to observe the levels of relevant neural plasticity protein N-methyl-D-aspartate receptor （NMDA receptor） in hippocampus， calcium/calmodulin dependent protein kinaseⅡ（CaMKⅡ）， protein kinase （PKA）， the phosphorylation level of CAMP response element binding protein （CREB） and the protein expression of brain derived neurotrophic factor（BDNF）. In this study， the authors found that the learning and memory functions and the hippocampus neural plasticity protein expression of the aged rat group were much lower than that of the young control group （P

[Key words] aged rat； Astragali Radix polysaccharide； neural plasticity

doi：10.4268/cjcmm20141125