β―榄香烯与人血清白蛋白相互作用的机制研究

[摘要] β-榄香烯作为一种抗肿瘤药物，是通过静脉注射后随血液循环达到靶器官发挥作用的，因此研究β-榄香烯与负责其血液运输的蛋白之间的关系就显得尤为重要。该实验采用荧光分光光度计研究了β-榄香烯与人血清白蛋白（HSA）之间的相互作用机制。HSA色氨酸残基的荧光淬灭直接反应其与β-榄香烯的结合情况，研究发现β-榄香烯对HSA的荧光淬灭是静态淬灭；根据计算不同温度下的结合常数及β-榄香烯与HSA结合物的焓，发现静电引力是β-榄香烯和HSA连接的主要原因。

[关键词] β-榄香烯；人血清白蛋白；荧光淬灭；静电引力

[收稿日期] 2014-01-29

[基金项目] 国家自然科学基金项目（81274180）

[通信作者] 刘屏，研究员，博士生导师，Tel：（010）66936676， E-mail：

[作者简介] 张淼，主管药师，主要从事医院药学工作， Tel： （010）66939401

β-榄香烯提取自中药材植物莪术Curcumae Phaeocaulis Rhizoma，β-榄香烯无论在体内还是体外试验中所表现出的抗肿瘤作用都是非常明确的[1-4]， 临床研究显示它还能提高病人的免疫力，且没有明显副作用、骨髓抑制及药物抵抗[5]。β-榄香烯是通过静脉注射后随血运到达靶器官的，因此β-榄香烯与人血清白蛋白（HSA）的连接状况会直接影响β-榄香烯的吸收、分布、代谢和清除，更与其抗肿瘤的效应密切相关。HSA是一种重要的细胞表面结合蛋白，在血清中有很高浓度的分布，具有许多特征性的重要生理功能。它由一个单多肽链包含585氨基酸残基组成，分为3个结构相似的域，每个域包含（A和B）2个子域。子域被2个二硫化物稳固的连接[6-7]。据报道芳香族和杂环药物与血红蛋白的体内转运就是依靠与其子域ⅡA和子域ⅢA的2个疏水袋（site Ⅰ和 site Ⅱ）的结合而完成的[8-10]。当药物与HSA发生相互作用时，Trp-214残基的荧光会被淬灭，这个特点经常被用来当做研究药物与HSA结合位点和结合机制的研究手段[11]。

1 材料

F-4500荧光分光光度计（日立，日本）；β-榄香烯购自中国食品药品检定研究院；磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾购自北京化工厂；二甲基亚砜（DMSO）购自北京Solarbio公司。

2 方法

2.1 试剂配制 PBS（pH 7.4）采用1.4 mmol・L-1 KH2PO4， 6.4 mmol・L-1 Na2HPO4，137 mmol・L-1 NaCl和 2.6 mmol・L-1 KCl配制而成，4 ℃保存备用；HSA用PBS溶解至80 mol・L-1，4 ℃保存备用；β-榄香烯配制为10 g・L-1的DMSO储存液备用。

2.2 不同浓度的β-榄香烯与HSA结合物的发射光谱 在一系列10 mL的量瓶中均加入浓度为80 mol・L-1的HSA溶液，然后边震动摇匀边依次缓慢加入不同浓度的β-榄香烯溶液，混合均匀，使β-榄香烯的终浓度依次为0，16，32，48，64，80，112，144，176 mol・L-1。于室温25 ℃下静置过夜，保证反应完全。设定激发波长为295 nm，激发与发射狭缝均为5 nm，用荧光分光光度计检测 80 mol・L-1的HSA在PBS（pH 7.4）中的发射光谱（λex 295 nm）。

2.3 检测不同浓度β-榄香烯对HSA荧光淬灭的影响 在浓度为50 mol・L-1的HSA溶液中，加入不同浓度（0，10，20，30，40，50 mol・L-1）的β-榄香烯，设置激发波长为295 nm，用荧光分光光度计检测β-榄香烯与HSA结合物在277，296，310 K的发射光谱。

3 结果

3.1 β-榄香烯与HSA相互作用光谱 当有小分子物质连接到HSA的时候，HSA会出现内荧光淬灭，即HSA上的色氨酸残基的荧光被淬灭，因此可以通过观察与药物反应前后HSA的荧光强度来判断药物与HSA之间是否发生相互作用。

在pH 7.4、反应温度25 ℃、激发波长为295 nm时，不同浓度的β-榄香烯可以使HSA的内源性荧光强度有规律地降低，且峰型及峰位基本保持不变（图1中A），说明β-榄香烯与HSA之间存在相互作用。同时，β-榄香烯与HSA浓度的比值与荧光强度呈线性关系，且β-榄香烯与HSA的浓度比1∶1时的斜率，说明β-榄香烯与HSA不是多重连接，而是直接连接在HSA的ⅡA区域Trp-214分区附近（图1中B）。

3.2 荧光淬灭机制 荧光淬灭分为静态淬灭和动态淬灭，静态淬灭是指淬灭剂分子与荧光物质分子之间形成了新的复合物；动态淬灭是淬灭剂分子与荧光分子的激发态分子之间的相互碰撞而导致的荧光淬灭。对动态淬灭，温度的升高将增加分子间的有效碰撞和加剧电子转移过程，使荧光淬灭常数随温度的升高而增大。相反，若温度的升高降低结合物的稳定性，使淬灭常数减小，则为静态淬灭。可根据Stern-Volmer方程计算，F0/F = 1+Kqτ0[Q] =1+Ksv[Q]（公式1）。其中F0代表无淬灭剂存在时的荧光强度，F为淬灭剂浓度为[Q]时的荧光强度，Kq代表生物聚合物的动态扩散淬灭常数，通常最大为2×1010 mol-1・s-1；Ksv代表动态淬灭常数，Ksv反映了生物大分子与荧光淬灭剂在动态淬灭过程中彼此扩散和相互碰撞达到平衡时的量效关系；τ0和 [Q]分别代表无淬灭剂状况下生物分子的荧光平均寿命（大概 10-9s）和淬灭剂浓度。

当温度分别为277， 296， 310 K时，按照实验方法测出加入不同浓度的β-榄香烯后HSA荧光强度的变化（图2）。随温度升高曲线斜率逐渐降低，表明β-榄香烯导致HSA荧光淬灭的淬灭过程是静态淬灭。通过求出不同温度下淬灭曲线的斜率和淬灭常数可进一步证明其淬灭过程。由图2和公式1得到HSA荧光淬灭的Stern-Volmer曲线，求得277，296，310 K时Ksv分别为5.521，4.188，3.354×104L・mol-1。显而易见，本实验中HSA的动态扩散淬灭常数远大于生物聚合物的分散淬灭常数的最大值，即说明β-榄香烯对HSA的荧光淬灭是静态淬灭。

3.3 结合常数 采用Lineweaver-Burk双倒数方程（F0-F）-1 = F0-1 + K-1F0-1[Q]-1（公式2）可以确定化合物与HSA相互作用的结合常数。由公式2，以（F0-F）-1为纵坐标，以[Q]-1为横坐标作图可以得到一条直线，直线的截距与斜率的比值即为结合常数K。

当温度分别为277，296，310 K时，β-榄香烯与HSA 的结合常数K分别为5.521，4.188，3.354×104 L・mol-1。说明β-榄香烯与HSA结合物之间存在较强的相互作用力，即β-榄香烯在体内能够被储存和转运（图3）。

3.4 热力学参数 范德华力的介入，例如氢键，离子键，静电力和疏水作用力等会有助于蛋白质与药物分子相互结合。蛋白质与β-榄香烯结合物的稳定性可以用热力学参数来描述。因为温度本身的影响是极小的，如果焓变ΔH在测定温度范围内变化不明显，焓变ΔH0和熵变ΔS0可以通过方程求得：lgK=ΔH02.303RT+TΔS02.303R（公式3）。其中K为不同温度下的结合常数，R为气体常数。而吉布斯自由能可以通过ΔG0=ΔH0-TΔS0（公式4）求出。由公式3和公式4计算得到β-榄香烯与HAS的热力学函数。在不同温度下ΔH0的值均为-9.569 kJ・mol-1，ΔS0的值均为55.92 kJ・mol-1，说明静电引力在HSA和β-榄香烯相互作用中占主导作用；而ΔG0的值随温度的不同而有所变化，277，296，308 K时值分别为-25.06，-26.12，-26.90 kJ・mol-1。β-榄香烯与HSA结合物的热力学参数中，ΔH0为负数ΔS0为正数，说明静电引力在β-榄香烯与HSA的连接中起到了重要作用（图4，表1）。

4 讨论

在激发波长为295 nm，固定HSA的浓度，不断增加β-榄香烯的浓度时，HSA的内源性荧光强度有规律降低，但峰位没有发生明显的移动，此结果表明β-榄香烯和HSA之间存在相互作用，可能是连接在HSA的ⅡA子域，使HSA分子上的色氨酸荧光被淬灭。且淬灭常数随温度的升高而降低，表明这种荧光淬灭的机制是β-榄香烯和HSA形成复合物引起的静态淬灭。利用双倒数模型发现β-榄香烯和HSA的结合常数约为1×104 L・mol-1，说明β-榄香烯可以被HSA储存和运输。

药物等有机小分子和蛋白质等生物大分子之间的结合力主要有疏水作用力、氢键作用力、范德华力和静电引力等。判断生物大分子与小分子之间结合力性质和生物大分子自身结合力性质的热力学规律，根据反应前后热力学焓变和熵变的相对大小，可以判断药物与蛋白质之间的主要作用力类型：即ΔH0>0，ΔS0>0为疏水作用力；ΔH0

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Spectroscopic studies on binding of β-elemene to human serum albumin

ZHANG Miao， ZHANG Lu-yong， DONG Xian-zhe， WANG Dong-xiao， LIU Ping

（1. Surgical Pharmacy， General Hospital of PLA， Beijing 100853， China；

2. Institute of Food and Cosmetics， Chinese Academy of Food and Drug Testing， Beijing 100050， China；

3. Department of Clinical Pharmacology， General Hospital of PLA， Beijing 100853， China）

[Abstract] β-Elemene is an antitumor drug which is isolated from the traditional Chinese medicinal herb Curcumae Phaeocaulis Rhizoma， it is the main component of elemene which is extracted from the plant and delivered via blood circulation after intravenous injection. The antitumor effect of β-elemene in vitro and in vivo was definite， and β-elemene could improve the patient immunity and no sever side effect， drug resistance or bone marrow suppression were found during the clinical studies. And human serum albumin （HSA） is a primary extracellular protein which has a high concentration distribution in blood plasma and has many characteristic physiological functions. Therefore， the binding of β-elemene to protein may be very important for absorption， distribution， metabolism and elimination， Therefore， the study on the interaction of β-elemene with drug-carrying protein is very important. In this work， molecular binding of β-elemene to human serum albumin （HSA） was investigated by using spectrofluorometer. the binding constants suggested that a strong interaction and the formation of a complex between β-elemene and HSA. This clearly implies that β-elemene can be stored and removed by the proteins in the body. Furthermore， the fluorescence quenching results showed that the HSA fluorescence was quenched by β-elemene through static quenching mechanism. Thermodynamic parameters showed that hydrophobic interactions play a role in the binding of β-elemene to HSA. The negative ΔH0 and positive ΔS0 in case of β-elemene therefore showed that electrostatic attraction play a role in the binding of β-elemene to HSA.

[Key words] β-elemene； human serum albumin； fluorescence quench； electrostatic attraction

doi：10.4268/cjcmm20141134