黄芪甲苷的生物样品稳定性考察及在大鼠体外肠菌中代谢转化研究

[摘要] 为明确黄芪甲苷（AST） 在生物样品中的稳定性和在大鼠体外肠菌代谢转化产物及代谢途径。本实验采用体外的方法对AST在人工胃液、人工肠液及大鼠肝匀浆中的稳定性以及大鼠离体肠道菌群中的代谢产物进行探讨。采用HPLC法测定AST在生物样本中的含量，计算AST在生物样本中的剩余百分率。采用TLC，HPLC和LC-MS/MS相结合的分析手段，鉴定代谢产物。结果发现，AST在人工胃液、人工肠液及肝脏中均较稳定，不易代谢；AST肠道菌群的代谢是通过脱糖基逐级进行的。首先，失去3位木糖基转化成次生代谢产物环黄芪醇-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（CMG）。然后，失去6位葡萄糖基得到极性更小的皂苷元环黄芪醇（CAG）。研究结果表明AST在体内主要在肠道代谢，发生糖基水解作用。即肠道菌群的水解作用是AST代谢的主要原因。

[关键词] 黄芪甲苷；稳定性；体外；肠菌代谢；代谢产物；代谢途径

黄芪为著名传统补气类中药，始载于《神农本草经》，具有扶正固本、益气活血、延缓衰老，调节免疫系统，抗菌及抑制病毒作用，降血糖及减少糖尿病并发症作用[1]。

黄芪甲苷（AST）又称黄芪皂苷Ⅳ，为黄芪内主要有效成分[2]。AST为大分子皂苷，其口服生物利用度不足3%，通过改变剂型等各种方式虽然提高了口服利用度[3-4]，但是AST吸收差的原因尚不清楚。目前很多研究证实皂苷类物质口服后在体内发生糖基水解，经肠道菌群转化后，代谢产物包括皂苷元作为主要物质进入血液发挥更大的药理作用[5]。然而，针对AST在体内吸收代谢转化及真正发挥药效的成分等问题鲜有报道。因而，本实验首先对AST在胃肠环境中的稳定性进行研究，然后探讨其体外的代谢特性，明确其代谢过程及转化部位，为新药和保健品合理开发提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器

Thermo Scientific液相色谱-质谱仪（Accela UV/Vis Detector， Accela Auto Sampler， Accela 600 pump， TSQ Quantum Access）；LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；高速离心机（北京白洋离心机厂）；TGL20M型高速冷冻离心机（长沙湘智志离心机仪器有限公司）；T10 basic电动匀浆机（德国IKA公司）；VORTEX GENIVS 3 漩涡混匀仪（IKA）；DKZ-450B型电热恒温振荡水槽（上海森信实验仪器有限公司）；MTN-2800D 型氮气吹干仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；C18 SPE柱（Agilent Technologies）；薄层层析硅胶-G预制板（青岛海洋化工厂）。

1.2 试药

AST和环黄芪醇（CAG）由北京美迪克斯生物技术有限公司提供（纯度>98%）；牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250、胃蛋白酶和胰蛋白酶（北京拜尔迪生物技术有限公司）；氧化型辅酶Ⅱ（NADPNa2）、葡萄糖-6-磷酸二钠（G-6-P-Na）和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PDH）为Sigma 产品（中生瑞泰有限公司）。实验中所用其他试剂均为市售色谱纯或分析纯。实验用水为娃哈哈纯净水。

1.3 动物

清洁级Sprague Dawley（SD）大鼠，体重（220±20） g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2011-0012。

2 方法

2.1 溶液配制

人工胃液和人工肠液：参照文献方法[6]制备。

AST供试品储备液制备：精密称取AST适量，加甲醇溶解，配制成质量浓度为5.0 g・L-1的AST储备液，使用时用甲醇稀释成所需浓度即可。

AST对照品溶液制备：精密称取AST对照品适量，加甲醇配制成质量浓度为0.1 g・L-1的溶液，作为AST对照品溶液。

CAG对照品溶液制备：精密称取CAG对照品适量，加甲醇配制成质量浓度为0.1 g・L-1的溶液，作为CAG对照品溶液。

2.2 TLC、HPLC及HPLC-MS检测条件

TLC法条件：硅胶-G薄层预制板，展开系统：CHCl3-CH3OH-H2O（8∶3∶1），10%浓硫酸乙醇溶液105 ℃加热5 min显色。

HPLC条件：Agilent TC-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm， 5 μm）；检测波长203 nm；流速1 mL・min-1；柱温为30 ℃；流动相为乙腈-水梯度洗脱0～20 min，乙腈的比例由37%变化到55%，水的比例由63%变化到45%。进样体积30 μL。

HPLC-MS条件：流动相为乙腈-0.01%甲酸，液相条件同该项下的HPLC条件。正离子检测模式；喷雾电压3 kV；喷雾温度400 ℃；毛细管温度270 ℃；鞘气（N2）20；辅助气（Ar）5；进样量5 μL。

2.3 AST的稳定性

2.3.1 AST在人工胃液中的稳定性 吸取AST储备液100 μL与10 mL预温孵至37 ℃的人工胃液混合后，置于37 ℃恒温振荡水浴中。平行制备3份。同时制备不加AST的空白样品。分别于反应0， 0.5， 1， 2， 3， 4 h取样，每个时间点取0.5 mL。在取出的样品中迅速加入1倍乙腈终止反应并沉淀蛋白，涡旋1 min使终止完全。将样品高速离心（15 000 r・min-1，20 min），取上清，HPLC进样分析。

2.3.2 AST在人工肠液中的稳定性 同2.3.1操作，将AST与人工肠液共温孵，分别于0， 0.5， 1， 2， 3， 4 h取样、处理。取上清，HPLC进样分析。

2.4 AST在大鼠肝匀浆中的代谢

2.4.1 NADPH启动系统制备 精密称取NADPNa2， G-6-P-Na， G-6-PDH和MgCl2适量，加水溶解并定容，体系含有2 mmol・L-1 NADPNa2，40 mmol・L-1 G-6-P-Na，4 U・L-1 G-6-PDH，40 mmol・L-1 MgCl2，-20 ℃保存。

2.4.2 样品制备 参照文献[7]法制备大鼠肝匀浆。首先在EP管中加入适量的AST甲醇溶液，水浴挥干溶剂，加入Tris缓冲溶液，大鼠肝匀浆，涡旋混匀。恒温振荡水槽37 ℃预温孵5 min。加入NADPH启动系统200 μL，涡旋混合均匀以启动反应。反应终体积为400 μL，含1.0 mmol・L-1NADPNa2， 20 mmol・L-1G-6-P-Na， 2 U・L-1G-6-PDH， 20 mmol・L-1MgCl2，肝匀浆蛋白质量浓度为2.0 mg・mL-1，底物终浓度为50 μmoL・L-1。 37℃水浴振荡温孵。于温孵0， 10， 40， 60， 120 min后分别加入冰乙腈0.4 mL终止反应。每个时间点平行5份。

2.4.3 样品处理 乙腈终止反应后，涡旋并超声5 min使混合均匀，高速离心（13 000 r・min-1，20 min，4 ℃），取上清，37 ℃水浴氮气流下挥干。残渣用400 μL甲醇复溶，超声使溶解完全，高速离心（13 000 r・min-1，20 min，4 ℃），上清供HPLC分析。

2.5 AST体外肠菌代谢

离体培养肠道菌群对AST的代谢，参照文献[8]法制备肠菌培养液。取新鲜配制的肠菌培养液共7份，每份5 mL，各加AST供试液20 μL，混匀，并随行制备空白对照，密闭恒温37 ℃厌氧培养。于0， 2， 4， 8， 12， 16和24 h取出，离心（4 000 r・min-1， 10 min），移出上清液，用已活化过的C18 SPE小柱纯化，最后保留于1 mL甲醇中。供TLC法检测及HPLC分析。另取24 h温孵处理液0.5 mL，氮气流下挥干，流动相1 mL复溶，高速离心（13 000 r・min-1， 30 min），取上清用于HPLC-MS测定。

以0 h组测得的AST质量为100%，按以下公式进行计算不同时间AST在人工胃液、人工肠液及大鼠肝脏中的剩余百分率。

R = mt / m0 × 100%

R：t时刻的AST剩余百分率；mt：t时刻AST的质量；m0：0时AST的质量。

3 结果

3.1 AST在人工胃液中的稳定性

记录AST在人工胃液中各时间点取样色谱峰面积，计算不同时间AST在人工胃液中的剩余百分率（%）。结果见图1。

由AST在人工胃液中代谢稳定性的实验结果可知，AST在人工胃液中几乎不发生代谢，基本保持稳定。

3.2 AST在人工肠液中的稳定性

记录AST在人工肠液中各时间点取样色谱峰面积，计算不同时间AST在人工肠液中的剩余百分率（%），结果见图2。

由AST在人工肠液中代谢稳定性的实验结果可知，AST在人工肠液中几乎不发生代谢，基本保持稳定。

3.3 AST在大鼠肝匀浆中的代谢

记录AST各时间的色谱峰峰面积，计算AST经不同时间代谢后的剩余百分率，测定结果见图3。

结果显示，AST在大鼠肝脏中几乎不发生代谢，可说明口服AST后，几乎无肝脏首关效应。

3.4 AST肠菌代谢TLC检测

由TLC图显示（图4），AST经肠道菌群代谢后主要产生2个代谢物；随着培养时间的延长，2个代

谢物的量逐渐增多；经TLC初步分析判定其中一个为次生代谢物，极性在皂苷与皂苷元之间，另一个为AST的皂苷元CAG。

另外，由图中也可看出，随着代谢时间的延长，有极性比皂苷元更小的物质出现。这可能是AST发生转化生成皂苷元后，又继续被代谢后产生的代谢产物。

3.5 肠菌代谢的HPLC测定

肠菌代谢物HPLC检测结果见图5。AST各代谢物分离良好，与对照品比较可知AST经肠道菌群作用可转化为一个次生代谢物及苷元CAG；空白无干扰。

HPLC图可见AST的2个主要代谢产物，其中一个为皂苷元CAG，另一个为极性介于AST与CAG之间的物质。HPLC检测结果与TLC的结果基本一致。

3.6 AST肠菌代谢物HPLC-MS检测及代谢途径分析

AST各代谢产物分离较好，空白无干扰。对样品进行一级质谱全扫描，各产物响应良好，见图6。

AST及肠菌代谢物的各时间点一级质谱检测结果为：tR = 5.92 min时，m/z 785.45，为AST的准分子离子峰[M+H]+；tR = 8.51 min时，m/z 653.41，比m/z 785.45减少了132，为AST失去1分子木糖所得的次生代谢物（CMG）[M-Xyl+H]+；tR =15.05 min时，m/z 513.34，比m/z 785.45减少了294，为AST失去1分子木糖之后继续失去1分子葡萄糖所得的皂苷元（CAG）[M-Xyl-Glc+Na]+。

对AST及代谢物的二级质谱检测发现，AST碰撞能量为20 ev，主要的碎片离子m/z 687， 529， 455， 143等；代谢物M1碰撞能量为25 ev，主要的碎片离子m/z 513， 455， 437， 419， 143等；代谢物M2碰撞能量为45 ev，主要的碎片离子m/z 455， 333， 143等。AST及肠菌代谢物的质谱结果见图7～9。

质谱结果显示，AST经肠道菌群转化后，2个主要的代谢产物分别为失去木糖基而生成的次生代谢物CMG和失去2个糖基得到的皂苷元CAG。质谱裂解规律图见图10。

综合TLC，HPLC及LC-MS/MS结果分析，AST经肠道菌群作用代谢得到脱糖基代谢产物，其一为失去3位基团木糖的次生代谢物CMG（M1），另一个为进一步失去6位葡萄糖得到的极性更小的皂苷元CAG（M2）。AST体外代谢途径，见图11。

4 讨论

AST在人工胃、肠液中的稳定性考察结果显示

其在胃肠液中均较稳定。通过AST的大鼠离体肠道菌群代谢分析，发现AST可被转化为失去3位木糖基的CMG和进一步失去6位葡萄糖得到的极性更小的皂苷元CAG。为进一步阐释AST在体内的代谢特性，本实验同时还探讨了大鼠肝脏对AST的代谢影响。结果显示，AST在大鼠肝脏中几乎不发生代谢。

Rui-Na Zhou等关于AST经大鼠肠道菌群代谢的文章[9]表明了AST在体内转化为皂苷元及皂苷元异构体，进一步佐证了本课题的结果。本实验在大鼠离体肠道菌群代谢研究的基础上，对AST大鼠体外肝代谢及其在人工胃、肠液中的稳定性等均进行了考察，证实了AST在体内是被肠道菌群水解，生成了脱糖基代谢产物，进而和其代谢产物共同进入血液循环从而发挥药效作用。

由本实验结果可推测，AST在胃肠道内吸收较差，可经肠道菌群转化发生糖基水解作用，且在肝脏中几乎不被代谢，口服后无首关效应。结合本课题组体内外代谢实验结果，推测AST和其代谢产物共同进入血液循环发挥药效作用。但吸收入血量和各代谢产物对发挥药效的贡献大小还需进一步研究。

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[9] Zhou R N， Song Y L， Ruan J Q， et al. Pharmacokinetic evidence on the contribution of intestinal bacterial conversion to beneficial effects of astragaloside IV， a marker compound of Astragali Radix， in traditional oral use of the herb[J]. Drug Metab Pharm，2012，27（6）：586.

Stability study in biological samples and metabolites analysis of

astragaloside Ⅳ in rat intestinal bacteria in vitro

SUN Gui-xia1， ZHAO Yuan-yuan1， MIAO Pei-pei1， YANG Xiao-yan1， MIAO Qing1， LI Jing2，

XUE Bao-juan1， SU Jin1， ZHANG Yu-jie1*

（1.School of Chinese Pharmacy， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China；

2.Traditional Chinese Medicine Dispensary， Beijing JiShuiTan Hospital， Beijing 100035， China）

[Abstract] To figure out the stability and intestinal bacteria metabolites of rats in vitro of astragaloside Ⅳ（AST）， this research was done to explore the stability of AST in the artificial gastric juice artificial intestinal juice and rat liver homogenate and the metabolism in rat intestinal in vitro. HPLC was used to calculate the remaining rate of AST in biological samples by measuring the content of AST， while metabolites were determined by combining the methods of TLC， HPLC and LC-MS/MS. It turned out that AST was difficult to metabolize in the artificial gastric juice， artificial intestinal juice and rat liver. Also， the metabolic pathway of AST was stepped by deglycosylation. Firstly， AST was converted to its secondary etabolites（6-O-β-D-glucopyranosyl- cycloastragenol，CMG） by removal of xylose moiety at C-3， then transformed into cycloastragenol （CAG） after hydrolytic removal of the glucose moiety at C-6. All the results suggested that the metabolism of AST in vivo occurs mainly in the intestinal by hydrolysis of glycosyl. In conclusion， hydrolysis of intestinal flora is the main reason that AST metabolizes.

[Key words] astragaloside Ⅳ； stability； in vitro； metabolism by intestinal bacteria； metabolites； metabolic pathways

doi：10.4268/cjcmm20142133