基于超高效合相色谱对黄芪中5种主要黄酮类化合物的快速检测

摘要：建立了利用超高效合相色谱法（Ultra performance convergence chromatography，UPC2）快速分离和测定黄芪中5种主要黄酮类化合物（毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、美的紫檀素、芒柄花苷、芒柄花素）的方法。黄芪样品采用80%乙醇提取后，以超临界CO20.2% H3PO4甲醇溶液为流动相，梯度洗脱，色谱柱为Waters ACQUITY UPC2 CSH柱（100 mm × 3.0 mm，1.8 μm），柱温为40℃，流速为0.4 mL/min，进样量为1 μL，检测波长为280 nm。整个分析过程仅需15 min，分析速度是传统液相色谱的3倍以上。结果表明：毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、美的紫檀素、芒柄花苷与芒柄花素的检出限及定量限范围分别在0.3～0.5 mg/kg和1.0～2.0 mg/kg之间，5种黄酮类成分的加标平均回收率均高于99.7%，相对标准偏差（RSD）小于2.2%（n=6）；在最优条件下，对13批不同产地的黄芪进行检测，毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、美的紫檀素、芒柄花苷与芒柄花素的含量范围分别在4.8～102 mg/kg、14～277 mg/kg、0～135 mg/kg、5.3～119 mg/kg及2.8～41 mg/kg之间；本方法简便快速，重复性良好，结果准确可靠，可用于黄芪药材中5种主要黄酮类成分的含量测定。

关键词 ：超高效合相色谱； 黄酮类； 黄芪

1 引 言

超高效合相色谱法（Ultra performance convergence chromatography，UPC2）是超高效液相色谱（UPLC）和超临界流体色谱（Supercritical fluid chromatography，SFC）技术的结合，它以超临界流体二氧化碳为流动相主体，依靠流动相的溶剂化能力进行分离与分析[1，2]。相对于传统超临界流体色谱重复性较差的缺点，UPC2能够通过精确调节流动相强度、压力和温度，在整个分离过程中获得较好的重现性；此外，由于CO2超临界流体具有较高的线速度及较低的密度，在分离过程中具有很高的柱效，且分析速度快，灵敏度高，有机溶剂使用量少。此外，CO2可与多数极性和非极性有机溶剂混溶，与气相色谱（Gas chromatography，GC）相比，超临界流体具有类似于液体的密度，为常压气体的200～500倍，具有较高的溶解能力，适于分离难挥发和热不稳定性物质，而气相色谱需将样品气化后才能进行分离操作，不适合于难挥发及热不稳定物质的分离；与液相色谱（Liquid chromatography，LC）相比，超临界流体具有较小的粘度，可减小过程阻力，在相同条件下，压力降比液相色谱的低，并且具有较高的扩散系数和传质速率，在分离操作时所用的时间短，单位时间内分离效能高[3～5]。

黄芪为常用补气药，《中华人民共和国药典》2010年版一部载黄芪为豆料植物膜荚黄芪（Astragalus membranaceus （Fisch）.Bge）或蒙古黄芪（A. membranaceus （Fisch ）Bgevar.mongholicus （Bge） Hsiao）的干燥根，其味甘，性温，归肺、脾经；具有补气固表、敛疮生肌等作用，临床用于气虚乏力，表虚自汗，气虚水肿，慢性肾炎蛋白尿和糖尿病等症[6]。研究表明，黄酮类成分作为其有效成分之一，有抗菌抗病毒、降血脂、抗氧自由基等作用，还具有抗缺血和改善血象作用[7～9]。

近年对黄酮类成分含量测定方面的报道较多，常见的为高效液相色谱法[10～12]，薄层色谱法[13～15]，液相色谱串联质谱法[16～19]等，对于液相色谱质谱法，因为仪器的价格昂贵，在国内还未被普遍使用；层析色谱及高效液相色谱法特异性不强，干扰物质较多、定量不准确，分析时间长，不能用于多种物质的同时测定。本研究采用超高效合相色谱法同时测定黄芪中5种主要黄酮类化合物，在15 min内实现了5种黄酮类化合物的分离。实验表明，本方法快速准确、灵敏度高、重复性好、实用性强，为黄芪中5种主要黄酮类化合物的定性与定量检测提供了一种高效可行的色谱检测方法。

2 实验部分

2.1 仪器、试剂与材料

超高效合相色谱仪（美国Waters公司），配有Waters EmpowerTM 3数据处理系统；3K30冷冻离心机（美国Sigma公司）；MS3涡旋仪（德国IKA公司）；移液枪（美国Thermo Electron公司，100～1000 μL、1.0～5.0 mL）。

毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、美的紫檀素、芒柄花苷、芒柄花素（纯度>98.5%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司）；CO2（纯度>99.997%，兰州汇能公司）；甲醇、乙腈、异丙醇、正己烷（色谱纯，德国Merck KGaA公司）；其余试剂均为分析纯。

根据黄芪药材的不同来源，将其依次编为1～13号，样品均在产地购买，原植物由兰州医学院生药植物室马志刚副教授鉴定为多序岩黄芪Hedysarum polybolrys HandMazz，均为栽培品。

2.2 标准贮备液配制

称取毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、美的紫檀素、芒柄花苷和芒柄花素适量，用甲醇溶解并定容至100 mL，分别配制成含100 mg/L毛蕊异黄酮、130 mg/L毛蕊异黄酮苷、236 mg/L美的紫檀素、206 mg/L芒柄花苷和232 mg/L芒柄花素的标准储备液，4℃下冷藏待用。

2.3 色谱条件

Waters Acquity UPC2 CSH Fluorophenyl色谱柱：（100 mm×3.0 mm， 1.8 μm）；流动相：A为CO2， B为甲醇；流速0.4 mL/min；进样量：1 μL；柱温30℃；检测波长280 nm；动态背压（Active back pressure regulator，ABPR）：11.72 MPa。梯度洗脱程序见表1。