我国平原与世居高原优秀竞走运动员血液MCT1和AE1mRNA差 异的研究

摘 要: 以国家竞走队优秀竞走运动员为研究对象,观察我国优秀竞走运动员20 d低氧暴露前后 血液酸碱调控能力的变化,并对世居高原与平原优秀竞走运动员酸碱调控能力的基因差异进 行比较,研究结果发现:20 d高原适应未能引起优秀平原竞走运动员MCT1mRNA和AE 1mRNA含量发生明显改变;世居高原竞走运动员AE1mRNA含量显著性高于平原运动员,说明从 遗传学角度分析,其红细胞运输能力优于平原运动员。结果提示,低氧环境对运动员的酸碱 平衡调节过程会产生一定的影响。在酸碱平衡调节方面,高原人群与平原人群存在遗传方面 的差异。

关键词:MCT1mRNA、AE1mRNA;优秀竞走运动员;世居高原

中图分类号:G804.7文献标识码:A文章编 号:1007-3612(2010)07-0045-03

A Research about the Difference in Blood MCT1 and AE1 Transpor ters Between Native Plateau andLowland Elite Race Walking Athletes

QIU Junqiang1, TIAN Ye2

(1. Beijing Sport University, Beijing100084, China; 2.China I nstitute of Sport Science, Beijing 100061, China)

Abstract: The paper examine the influence of 20 days hypoxia adaption on lowland elite rac e walking athletes on the mRNA of MCT1 (lactateH+ cotransporter) and AE1 ( Cl - HCO3-exchanger),and the difference in blood MCT1 and AE1 transportersbetween native plateau and lowland elite race walking athletes. The results sho wed that: 1. there was no significant difference in mRNA of MCT1 and AE1 beforeand after the 20 days altitude training. 2. There was a higher AE1 in nativeplateau compared with lowland elite race walking athletes. It seemed that theyhad a better ability in dynamic buffer capacity. In conclusion, 20 days of alti tude training had no significant results in improvements of buffer capacity in b lood, but the native plateau elite race walking athletes had a better ability indynamic buffer capacity inferred from the unregulated mRNA of AE1.

Key words: MCT1mRNA,AE1mRNA,elite race walking athlete,native plateau

人体酸碱平衡调节是高原适应过程重要的调节机制之一。乳酸快速跨膜转运至血浆的过程, 是机体即使进行极量强度运动、大量H+积累时,骨骼肌仍能使肌细胞内pH值维持动态平衡 的分子基础。MCT转运蛋白(monocarboxylate transporter)是完成这一功能的主要蛋白。 AE1是红细胞膜上特异性转移Cl--HCO3-的载体蛋白,称为阴离子交换蛋白(anio n exchanger, AE1)。AE1水平的提高可以促进红细胞摄取和释放CO2,CO2卸载能 力的提高意味着O2转运能力的提高。本研究从MCT转运蛋白和AE1载体蛋白mRNA基因表达 的角度,观察我国优秀竞走运动员20 d低氧暴露前后血液酸碱调控能力的变化,并对世居高 原与平原优秀竞走运动员酸碱调控能力的基因差异做了比较。

1 研究对象与方法

1.1 实验方案 实验对象为10名国家竞走队优秀平原竞走运动员(均为国际健将),进行20 d高原训练(云 南呈贡,高度为1 890 m),上高原前和离开高原当天取晨起静脉血,EDTA-3K+抗凝 。观察:低氧前后血细胞氢离子转运蛋白MCT1和HCO3-转运蛋白AE1的mRNA基因表 达的差异;选择国家竞走队世居平原的优秀竞走运动员8名与世居高原的优秀竞走运动员6名 (均为国际健将),取晨起静脉血,EDTA-3K+抗凝。观察:两组受试者血细胞氢离子 转运蛋白MCT1和HCO3-转运蛋白AE1的mRNA基因表达的差异。

1.2 mRNA基因表达测试方法 用EDTA-3K+抗凝真空管取的5 mL静脉血分出3 mL,取白细胞,用RT-PCR法测血液MCT 1和AE1的基因表达,操作过程如下:

1.2.1 RNA提取1) 取白细胞提取物,在液氮中研磨,研成粉末,转移进5 mL的离心管中。

2) 向离心管中加入2 000 μL变性液,充分振荡,使沉淀完全溶解。

3) 12 000转/min离心5 min,弃沉淀。

4) 加入200 μL氯仿充分混匀,12 000转/min离心5 min。

5) 小心吸取上层水相,加入等体积抽提液,温和混匀,12 000转/min离心3 min。

投稿日期:2009-12-30

作者简介:邱俊强,副教授,博士,研究方向高水平运动员的训练 监控。6) 重复步骤5。

7) 吸取上清,加1/10体积3N醋酸钠(pH5.2),1倍体积的异丙醇,-20℃放置1 h。

8) 12 000转/min离心10 min,弃上清。

9) 加入500μL75%的乙醇,振荡混匀12 000转/min离心10 min,弃上清。

10) 重复步骤9。

11) 室温晾干,约30 min或4℃冰箱过夜。

12) 加入约50 μL水溶解。

13) 测OD值计算RNA含量。

14) RNA电泳,紫外灯下应清晰可见18S,28SRNA带。

1.2.2 cDNA合成和PCR扩增1) 取1 μLRNA(1 ug/μL)样品,加入0.5 mL离心管中,按照以下参数加入试剂:

聚体随机引物 0.1 μL(50 ng)

AMV5×buffer:3 μL

dNTP(10 mM):0.4 μL

RNasin(40 u/μL)1 μL

AMV(5 μ/μL)0.5 μL

H2O(DEPC处理)9.0 μL。

2) 离心数秒,42℃保温30 min。94℃灭活AMV5 min。

3) 取5 μL cDNA模板按下列参数加入试剂:

10×PCRbuffer2.0 μL

dNTP(10mM)0.5 μL

b-actin引物0.5 μL(50 ng)

特异引物0.5 μL(50 ng)

Taq酶(2 u/μL)0.5 μL(1 u)

H2O(DEPC处理)16 μL

其中引物序列如下:

MCT1引物序列:237bp

256-275:5-CGTCCAGTAATGATCGCTGGTGG-3

492-453:5-AGGAACACAGGGCTGCCTG-3

AE1引物序列:749bp

1015-1036:5-GCCCCTTCAGAAAAAGCTCTGC-3

1765-1646:5-TGTGTTGGGCACAGGGCC-3

b-actin内参照序列:545bp

F:tcc cgg cat gtg caa ggc c

R:cat ctc ttg ctc gaa gtc ca

4) 离心数秒,按下列参数扩增30轮:

94℃ 预变性 2 min

94℃ 变性45 s

55℃ 复性45 s

72℃ 延伸45 s

72℃ 延伸加时1 min

5) 取15 μLPCR扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶进行电泳,紫外灯下拍照,显影定影,记录 结果。

6) 用Gel Pro3.0软件分析结果,得到目的基因与b-actin的灰度值比值。

1.3 统计学处理 实验数据采用SPSS12.0统计学软件进行 统 计学处理和相关T检验。实验结果表示为平均数±标准差,显著性检验采用双侧T检验,显 著性标准为P

2 实验结果

本文采用RT-PCR的方法,用b-actin为内参照基因,观察平原运动员和世居高原运动员 血液系统乳酸/H+转运载体MCT1和阴离子转运载体AE1(HCO3-/ClA-)mRNA 的相 对含量。电泳结果见图1、图2。图中可见清晰的MCT1(237 bp)和AE1(749 bp)条带 。

图1 MCT1和b-actin基因RT-PCR照片 图2 AE1和b-actin基因RT-PCR照片 表1 我国优秀平原竞走运动员20 d高原训练前后MCT1和AE1mRN A的变化

分组NAE 1/B-actinMCT1/B-actin高原训练前80.84±0.080.53±0.06高原训练后100.84±0.060.54±0.05图3(A) 我国优秀平原竞走运动员20 d高原训练前后MCT1和AE1mRNA的变化 表2 我国优秀竞走平原运动员与世居高原运动员MCT1和AE1mRN A含量比较

分组NAE 1/B-actinMCT1/B-actin平原组80.84±0.080.53±0.06世居高原组60.90±0.04*0.56±0.05注:*表示与平原组比较有显著性差异,P

从实验结果可见,20 d高原适应并未造成我国优秀平原竞走运动员血液系统AE1 mRNA基 因表达发生明显变化;转运蛋白MCT1出现增高趋势但无显著性差异。世居高原的优秀竞走 运动员与平原运动员相比,这两种转运蛋白的mRNA均高于平原优秀运动员,其中Cl-- HC O3-的载体蛋白AE1显著高于平原运动员。

图3(B) 我国优秀竞走平原运动员与世居高原运动员MCT1和AE1mRNA含量比较

3 分析与讨论

高原低氧环境和运动训练,都可以使机体的酸碱平衡发生改变。因此,运动 机体酸碱平衡能力以及调节机制的改善,很大程度上决定了运动员低氧适应效果的好坏。已 经证实,在环境适应过程中,酸碱平衡状态和细胞外缓冲能力发生适应性变化,这种适 应性改变的潜在性机制可能跟骨骼肌和血液系统内与pH调节及乳酸转运有关的载体蛋白水平 有关[1]。因此,本文采用RT-PCR的方法,研究了血液系统内与pH调节及乳酸转运 有关的载体蛋白在反转录水平是否存在差异。

本研究结果显示:20 d亚高原适应并未造成竞走运动员血液系统AE1 mRNA基因表达发生明 显变化;转运蛋白MCT1出现增高趋势但无显著性差异。世居高原的优秀竞走运动员与平原 运动员相比,这两种转运蛋白的mRNA均高于平原优秀运动员,其中Cl-- HCO3-的载 体蛋白AE1显著高于平原运动员。

乳酸/H+转运载体(Lactate/H+ co-transport)的作用是将在运动中产生的乳酸阴离子 通过穿梭作用转运到细胞外。乳酸的快速跨膜转运至血浆过程,是机体即使进行极量强度运 动、大量H+积累时,骨骼肌仍能使肌细胞内pH值维持动态平衡的分子基础。H+通过Lact ate/H+ co-transport的转运能力很强,MCT转运蛋白(monocarboxylate transporter) 则是完 成这一功能的主要蛋白,它按照1:1的方式,双向可饱和性地调节H+和乳酸浓度[2 ]。在红 细胞膜上,MCT蛋白的主要亚型为MCT1。已有研究发现,高原训练对红细胞膜上MCT1蛋 白表达的作用是非常显著的,使MCT1的蛋白表达量明显增多[3]。MCT1蛋白表 达量增高 对运动时的乳酸动力学起到积极的意义[4]。在红细胞膜内外,乳酸跨膜平衡的半 时反应时 为50 s[5],8周高原训练后,MCT1蛋白表达量增高5倍,意味着乳酸跨膜平衡的 半时反应 时缩短了10 s。运动中红细胞对乳酸和氢离子摄取能力的提高,降低了血液体系的局部酸化 ,更有利于降低肌肉组织和血液系统之间的浓度梯度。

但在本研究中,20 d高原适应后,优秀平原竞走运动员MCT1mRNA含量没有出现显著性增高 ,这可能与低氧适应的高度较低,以及暴露时间较短有关。世居高原组运动员MCT1mRNA 含量高于平原组,但无统计学意义。

AE1是红细胞膜上特异性转移Cl-- HCO3-的载体蛋白,称为阴离子交换蛋白(ani on exchanger, AE1)。Juel C(2003)研究中发现,2周和8周的高原训练均使AE1蛋白 表达量出现明显增高,分别增高149%和228%。有研究认为,阴离子交换过程是HCO3- 生成 和排出的限速步骤[6]。AE1水平的提高可以促进红细胞摄取和释放CO2,尤其 是对于肺 泡组织来说,CO2卸载能力的提高意味着O2转运能力的提高。因此,AE1载体蛋白对红 细胞功能有着至关重要的作用。在本研究中,优秀平原运动员在20 d高原适应后,AE1mRN A含量未发生明显改变,可能与低氧适应的高度较低,以及暴露时间较短有关。但世居高原 的竞走运动员,其AE1mRNA含量显著性高于平原运动员,说明世居高原会对血液系统发生 适应性改变,这一适应性改变对提高红细胞的运输功能,是起着积极意义的。

结果提示,低氧环境对运动员的酸碱平衡调节过程会产生一定的影响。在酸碱平衡调节方面 ,高原人群与平原人群存在遗传方面的差异。为获得平原-高原-平原环境下的快速适应,需 重视酸碱平衡调节在运动中发挥的作用。

4 结 论

20 d高原适应未能引起优秀平原竞走运动员MCT1mRNA和AE1mRNA含量发生明显改变;世 居高原竞走运动员AE1mRNA含量显著性高于平原运动员,说明从遗传学角度分析,其红细 胞运输能力优于平原运动员。

参考文献:

[1]Wagner PD, Araoz M, Boushel R, Calbet JAL, Jessen B, R?degran J, S pielvogel H, S?dergaard H, Wagner H & Saltin B. Pulmonary gas exchange and acid -base state at 5,260 m in high-altitude Bolivians and acclimatized lowlanders[ J].J Appl Physiol,2002,92:1393-1400.

[2]Juel C, Lactate/H+ co-transport in skeletal muscle: regulation and impor tance for pH homeostasis[J].Acta Physiol Scand,1996,156:369-374.

[3]Juel C, Lundby C, Sander M, etal.Human skeletal muscle and erythrocyteproteins involved in acid-base homeostasis: adaptations to chronic hypoxia J Phy siol,2003, 548(2):639-648.

[4]Messonnier L, Kristensen M, Juel C Importance of pH regulation and lactate /H+ transport capacity for work production during supramaximal exercise in hum ans[J].J Appl Physiol,2007,102(5):1936-44.Epub 2007 Feb 8.

[5]Juel C, Bangsbo J, Graham T & Saltin B Lactate and potassium fluxes from h uman skeletal muscle during and after intense, dynamic, knee extensor exercise[ J].Acta Physiol Scand,1990, 140:147-159.

[6]Reitmeier RAF,. A membrane metabolon linking carbonic anhydrase with chlo ride/bicarbonate anion exchangers[J].Blood Cells Mol Dis,2001,27:85-89 .