热休克蛋白27与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在原发性肝癌组织中的表达及其临床意义

[摘要] 目的 通过检测热休克蛋白27（HSP27），磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）在原发性肝癌中的表达，探讨两者在诊断原发性肝癌及临床病理特征的意义。 方法 采用免疫组织化学染色SP法检测重庆市巴南区人民医院32例手术切除的原发性肝癌组织、30例肝硬化组织、25例肝脏良性占位组织及31例肝炎组织中GPC3、HSP27的表达，并分析其与原发性肝癌临床因素之间的关系。 结果 HSP27其在肝癌组织中高表达阳性率为56.25%（18/32），GPC3在肝癌中的阳性率为87.50%，HSP27和GPC3均在肝癌组织中高表达，与肝硬化、肝脏良性占位、肝炎组织中的表达水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。HSP27在肝癌组织的表达与肿瘤的病理分级及TNM分期有关，但GPC3的表达与肿瘤的病理分级及TNM分期无关。 结论 HSP27、GPC3在肝癌组织中高表达，与肝癌的发生、发展、转移有密切联系，可能成为新的肿瘤标志物。

[关键词] 热休克蛋白；磷脂酰肌醇蛋白聚糖3；原发性肝癌；免疫组织化学

[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）08（b）-0007-04

原发性肝癌（primary hepatic cancer，PHC）是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高，往往发现的时候已属晚期，治疗效果差，故早期诊断对于肝癌患者的预后至关重要。甲胎蛋白（AFP）目前是唯一应用最广的肝癌标志物，在肝癌的诊断、治疗及疗效监测中具有重要的作用。但是在活动性肝病，妊娠、生殖腺胚胎源性肿瘤和少数肾、胰、结肠、直肠癌也可有AFP的增高，显示AFP诊断肝癌的局限性。由于肝细胞癌具有较高的异质性，同时检测2种或以上的肿瘤生物标志物被认为是肿瘤早期诊断的较好选择[1-2]。

热休克蛋白27（HSP27）是小分子热休克蛋白亚家族中重要的一员，参与了细胞的增殖、分化以及细胞凋亡的信号转导调节，与肿瘤关系密切，是一个涉及到细胞生长、细胞凋亡、肿瘤的发生和转移等功能的重要蛋白，在乳腺、肝、结肠、肺等多种肿瘤细胞中异常过表达，并与肿瘤的恶性程度有关[3]。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3，GPC3）在肝癌组织中高表达，而在非肝癌组织及正常组织中没有表达或表达量极低，其表达的阳性率高于AFP，其有可能成为用于诊断PHC的新的肿瘤标志物[4]。本实验通过免疫组织化学方法检测肝癌、肝硬化、肝炎、良性肝脏占位组织中的HSP27与GPC3的表达情况，探讨这二者在肝癌中的诊断价值及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

32例肝癌组织、30例肝硬化组织、25例良性肝脏占位组织（14例肝囊肿、11例肝血管瘤组织）取自重庆市巴南区人民医院（以下简称“我院”）肝胆外科，慢性肝炎的31例组织标本取自我院消化内科及感染科。其中肝癌组织为术前未经放疗、化疗的原发性肝癌患者的手术切除标本，均取无坏死癌组织和无癌细胞浸润的癌旁组织。30例肝硬化组织中男20例，女10例，年龄36～48岁。32例肝癌患者中男22例，女10例，年龄39～83岁（≤50岁者12例，>50岁者20例）。血清HBsAg阳性者18例，阴性者14例；AFP≤400 μg/L者18例，>400 μg/L者14例；瘤体直径≤5 cm者14例，>5 cm者18例；肿瘤组织Edmondson-Steiner分级：Ⅰ级6例，Ⅱ级14例，Ⅲ级2例，Ⅳ级10例；肝癌TNM分期Ⅰ期16例，Ⅱ期2例，Ⅲ期12例，Ⅳ期2例。研究对象年龄、性别等一般资料差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。

1.2 试剂与方法

HSP27-抗（鼠抗人heat shock protein 27单克隆抗体），GPC3-抗（鼠抗人Glypican 3单克隆抗体）均购自福州迈新生物技术开发有限公司，ChemMateTM EnVision/HRP兔/鼠通用型二抗购自基因科技（上海有限公司），10 mmol/L磷酸盐缓冲液（PBS）、苏木精。操作按说明书进行。

1.3 结果判定

每张切片在400倍显微镜下随机取5个视野，每视野计数100个癌细胞为基数，按阳性细胞所占比例的平均数为评定阳性的依据。分为阴性（-），细胞无染色或阳性细胞 < 5%；弱阳性（+），阳性细胞占5%～25%；阳性（++），阳性细胞占< 25%～50%；强阳性（+++），阳性细胞>50%。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0对实验数据进行分析，计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HSP27在肝癌、肝硬化、肝炎、良性肝脏占位组织中的表达

Hsp27主要表达在细胞质，少数可见胞膜表达，呈棕黄色。其在肝癌组织中高表达阳性率56.25%（18/32），而在癌旁不同距离的正常组织中未见表达；HSP27在30例肝硬化组织中的阳性率为20.00%（6/30），与其在肝癌组织中的表达差异有统计学意义（P < 0.05）；而在肝炎组织、良性肝脏占位组织中均未见表达，见图1。根据阳性细胞比例及染色强弱，HSP27在肝癌组织中的表达形式可以分为阳性表达，弱阳性表达，见图2。

2.2 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在肝癌、肝硬化、肝炎、良性肝脏占位组织中的表达

GPC3主要表达在胞质中，呈棕褐色。其在肝癌组织中高表达（阳性率87.50%，28/32），在距肿瘤不同距离的癌旁组织中偶见表达（3/32）；GPC3在肝硬化组织中的阳性率为40.00%（12/30），与其在肝癌组织中的表达差异有统计学意义（P < 0.05）；在肝炎组织、良性肝脏占位组织中均未见表达，见图3。根据阳性细胞比例及染色强弱，可分为弥漫强阳性表达，弥漫弱阳性表达，局灶弱阳性表达，见图4。

2.3 HSP27、GPC3的表达与原发性肝癌临床特征的关系

如表1所示，HSP27在肝癌组织的表达，与肝癌细胞的分化程度及临床分期有关（P < 0.05），在Ⅲ～Ⅳ级及Ⅲ～Ⅳ期的肝癌组织中的HSP27的阳性率分别为100.00%、85.70%，明显高于Ⅰ～Ⅱ级及Ⅰ～Ⅱ期肝癌组织的HSP的阳性率；HSP27的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、HBsAg定性和AFP定量无相关性，但与肝癌的病理分级、TNM分期有关（P < 0.05）；GPC3在肝癌组织的表达与肿瘤病理分级、临床分期、肿瘤大小、HBsAg定性和AFP定量无相关性，但在性别、年龄上的差异有统计学意义（P < 0.05）。

3 讨论

HSP27是功能很强并普遍存在的一种分子伴侣，其重要的生物学功能包括保护细胞免受各种应激因素的损伤、参与细胞增殖分化，在细胞凋亡的多个关键点起作用，在癌细胞中表达水平很高，并参与癌症的发生、发展、转移和化疗抵抗等。HSP27在一些肿瘤中呈现高表达，包括乳腺癌、神经母细胞瘤、消化道肿瘤等多种恶性肿瘤，并与肿瘤的恶性程度及TNM分期有关[5]。对人肝细胞肝癌的肿瘤组织、正常人及HBV感染者的血清蛋白质组学研究发现在恶性程度高、侵袭性强的肝癌组织及肝癌患者血清中HSP27呈高表达[6]。有研究表明，在对76例原发性肝癌患者的单一诊断及平行诊断中，HSP27单项的敏感性为59.21%，特异性73.13%，阳性预测值是71.43%，当HSP27与经典标志物AFP相结合检测PHC时诊断的敏感性为78.95%，特异性77.61%，阳性预测值是80.00%[7]。本研究结果提示，HSP27在32例肝癌中的阳性率明显高于肝硬化，而在肝炎、良性肝脏占位组织中均未见表达，且与癌组织的病理分期及TMN分级有明显相关性，低分化及晚期转移性肝癌HSP27的阳性率明显偏高，而与肝癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、HBsAg定性和AFP定量等因素均无显著性相关，这与文献报道[8]研究结果相一致，笔者推测HSP27蛋白在肝癌的发生、发展及转移中发挥重要作用。

GPC3是一种参与细胞增殖和胚胎发育的细胞膜糖蛋白，其在细胞增殖与分化的发展过程中发挥重要作用，通过结合胞外基质，生长因子和蛋白酶等对细胞生长分化，以及肿瘤形成和转移起重要作用[9]。Hsu等[10]报道了在191例PHC组织中，143例（74.8%）能检测到GPC3 mRNA，而在156例癌旁“非瘤”肝组织中仅有5例（3.2%）为阳性，该5例均为有门脉或远处转移的病例。GPC3 mRNA及其蛋白在PHC组织中的阳性率通常为70%左右，而在正常肝脏、肝脏良性肿瘤、慢性肝炎和肝硬化等中均呈阴性[11-12]。Capurro等[13]研究表明在29例HCC组织中，21例GPC3蛋白表达阳性，而在正常肝组织及良性肝病组织中未检测到GPC3蛋白，而后用ELISA法检测血清中GPC3蛋白，结果发现在34例HCC患者中有18例（53%）GPC3蛋白浓度明显升高，而在20例肝硬化合并慢性肝炎的患者中仅有1例GPC3蛋白浓度升高。丁光辉等[14]研究发现GPC3 mRNA的表达与包膜是否完整、有无癌栓形成、有无肝内转移、性别、年龄及HBsAg均无明显相关性。本研究结果显示，GPC3在肝癌中的阳性率为87.50%明显高于肝硬化组织（阳性率为40.00%）（P < 0.05），在肝炎、良性肝脏占位组织中均未见表达，同时GPC3与肿瘤的病理分级、临床分期、大小、HBsAg定性和AFP定量等无相关性，与以往研究报道[10-14]相一致，这再次证实了GPC3与肝癌有着密切的联系，表明GPC3可作为新的肝癌肿瘤标志物。而GPC3在患者性别、年龄方面的统计学差异有可能与样本数量较少有关，故进一步的大样本研究是必要的。

综上所述，HSP27和GPC3在肝癌组织中高表达，而在肝硬化组织中低表达，在肝炎、良性肝脏占位组织中不表达，表明HSP27和GPC3与肝癌的发生、发展和转移有着密切联系，可成为潜在的肝癌诊断标志物，对提高肝癌的检出率以及肝癌预后判断都有重要意义，进一步的研究以明确HSP27及GPC3表达调控异常在肝癌发生中的机制，可能为肝癌的靶向治疗开辟新的前景。

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（收稿日期：2013-05-21 本文编辑：卫 轲）