热休克蛋白范文

热休克蛋白篇1

关键词:热休克蛋白;结构;功能;针灸;中药

中图分类号:R456 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)04-0718-03

Comparison of Different Heat Shock Proteins and Their Relationship with the Chinese Medicine

HUANG Yun,Advisor:LING Yaping

(Department of Acu-moxibustion and Massage,Hunan College of Chinese Medicine,Changsha 410208,Hunan,China)

Abstract:Heat shock protein is a group of highly conserved protein molecules family who has important physiological functions. Physiology, pathology and environmental factors can be induced by heat shock protein production, it is also known as stress proteins. According to molecular size and degree of homology, HSPs can be divided into HSP110, HSP90, HSP70, HSP60, small molecular HSP family of five major. Current,We studied HSP90, HSP70 most, but few on the HSP110. HSPs have much in common, but each HSP family has a unique structure and function. HSPs can protect the body , so try to find a no toxic side effects of HSPs induction agent or method has become an active area of research at home and abroad. Acupuncture and Chinese medicine of Traditional Chinese Medicine can affect the expression of HSPs.We make a review aboutthe structure、function of the HSPs and the relationship with Chinese medicine.

Key words:heat shock protein ; structure; function ; acupuncture Chinese medicine

收稿日期:2009-11-11

基金项目:国家自然科学基金资助项目(30772707 )国家教育部博士点科研基金资助项目(20070541003)

作者简介:黄芸(1984-),女,湖南耒阳人,硕士研究生,研究方向:经脉脏腑相关机理研究。

通讯作者:林亚平(1956-),女,湖南长沙人,教授,硕士研究生导师,研究方向:经脉脏腑相关机理研究。

热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是Ritossa在1962年首先发现的,当时在研究果蝇唾液腺染色体时发现一种在细胞高温应激时能产生对细胞有保护作用而且高度保守的蛋白质[1]。HSPs每个家族针对不同的亚细胞结构都有组成性和诱导性表达,如HSP60和HSP90在哺乳动物中为组成性表达,而HSP70和HSP27在受到高热、氧化应激或抗癌药物刺激时的高表达为诱导性表达。

HSPs的功能[2]主要有 :①维持细胞蛋白自稳。②“分子伴侣”作用。③提高细胞对应激原的耐受性。④参与免疫调节,增强免疫功能。⑤既有直接的神经元保护作用,又可诱导其他保护性机制的产生,直接或间接参与神经元的自身保护。⑥参与细胞周期的调节。

HSPs的分子生物学特性[3]:①生物界的普遍性。自然界所有的原核和真核生物都有HSP。②高度保守性。不同物种有同源性很高的HSP,其中氨基酸序列有50%～90%的一致性, 但不同家族HSPs之间则无明显序列同源性。③非特异性。除热环境以外,其他的物理、化学及生物应激原,如缺血、缺氧、感染、创伤、重金属离子、氧自由基等均可诱导HSPs的产生。④交叉耐受性。是指一种应激刺激诱导细胞产生HSPs后,不仅使细胞对该刺激的耐受性增加,也增加了细胞对其他应激原刺激的耐受性。⑤模拟性。指能以分子模拟宿主自身抗原,兼具迷惑宿主与致病的两重性。⑥双重性。指有自身抗原和特异抗原,能引起抗感染免疫及肿瘤防护,又能诱导多种自身免疫病及感染炎症。

除了上述的共同特点外,各个热休克蛋白家族又有独特的结构、功能及生物学特性。

HSP90:HSP90家族成员主要有HSP90α、HSP90β和gp96(Grp94)。HSP90 在胞浆内主要以同源二聚体的形式存在,每个同源二聚体又由2 个单体构成。HSP90 单体包括3 个主要的结构域:由1个保守的25×103的N 末端结构域和1个55×103的C末端结构域和1个中间结构域[4]。其N端结构域是结合底物蛋白结构域,类似蛋白酶结合底物口袋,C端为寡聚化结构域[5]。HSP90是胞浆蛋白,它通过与靶蛋白的活集团的结合,使其维持所谓“无活性稳态”。HSP90通常可逆性地结合并稳定胞浆中受体分子的活性结合位点,从而避免这些结构与胞浆中的其它生物分子形成聚合体而失活[6]。在抑制细胞凋亡、促进细胞存活上,HSP90主要作用于抑制IκB降解的各个通路上。HSP90能直接与Akt相互作用,抑制它的去磷酸化。磷酸化的Akt能使Bcl-2家族的Bad和caspase-9磷酸化,使它们的活性受到抑制,促进细胞存活。

HSP90作为HSPs 重要成员之一,在肿瘤中研究和应用最多。HSP90在肿瘤细胞中主要处于活化态,而在正常细胞中则主要处于静默态。pp60v2src 是第一个被发现能与HSP90 作用的原癌基因,它能够与HSP90 形成HSP902pp60v2src复合体。P53基因突变是至今已知的与人类癌症相关的最普遍的基因异常, HSP90 也能够和突变型p53 特异性结合,导致突变型p53 复合体的积聚和半衰期的延长[7]。HSP90 还参与肿瘤血管的生长、侵袭及转移。研究表明抑制HSP90 的功能可对肿瘤达到“多点攻击”,达到抑制肿瘤的生长和转移。HSP90抑制剂可以通过特异性抑制HSP90 阻断肿瘤生长转移信号网络通路中的多个靶点,还能逆转肿瘤的耐药性,使肿瘤对化疗药物敏感性增加。HSP90及其抑制剂是目前抗肿瘤研究的热点和前沿[8]。

HSP70:HSP70家族包括GRP75,GRP78,BIP,HSP68,HSP72,HSC70等。根据表达形式的不同可分为结构型和诱导型两种:HSC70固定表达存在于胞液与细胞核中,被称为结构型HSP70;诱导型HSP70(又称为HSP72或HSP70)为高度应激所诱导。通常所指的HSP70即诱导型HSP70[9]。HSP70蛋白由两部分组成,即ATP酶区(AT-Pase domain)和底物识别区或叫多肽结合区(pep-tide-binding domain)[10]。HSP70是膜结构相关蛋白,其生物学作用主要是结合靶蛋白的疏水片断而防止肽链的错误盘绕。在细胞受到环境变化和有害刺激时,细胞的一部分结构和功能蛋白发生变性,在正常状态下处于分子内部的疏水片断暴露“外化”,而形成不稳定的空间结构。HSP70则通过与这些疏水片断的结合而稳定其结构,并通过复杂的分子间相互作用,利用水解ATP的能量,协助变性蛋白的复性[11]。在控制细胞凋亡中,HSP70高表达能抑制caspase的激活、线粒体的损伤和核断裂。可以通过直接或间接地抑制MEK激酶抑制JNK的磷酸化,还可作为天然的抑制蛋白结合到JNK,抑制其活性,从而抑制JNK细胞凋亡通路。

HSP70是HSPs中反应最为敏感研究最多最深入的。在临床上,HSP70与癫痫、心脑缺血、多发性硬化、感染、肿瘤等多种疾病关系密切。在脑血管病和心血管病中对心肌细胞和脑细胞有显著的保护作用,减少细胞缺血坏死范围,修复损伤蛋白质,提高细胞对缺血的耐受性[9,12]。急性脑创伤后在易受损伤区域的神经元HSP70的转录表达,能减少神经细胞凋亡,有助于延迟神经细胞的死亡,与神经保护关系最为密切[13-14]。HSP70可与突变型P53形成稳定复合物,从而使核内P53转移到胞浆中,丧失了控制细胞增殖的能力。HSP70可以激发抗肿瘤细胞的特异性反应,结合细胞内的全部异常肽库,因此HSP70 - 肽疫苗可以是多价的,这有利于防止免疫逃逸从而增强免疫效果,为肿瘤疫苗开发提供了新的思路。

HSP60:真核生物的HSP60主要位于线粒体内(约70～80%),另有小部分位于胞浆。此外, HSP60存在于某些细胞的分泌颗粒中,例如胰岛的β细胞。HSP60是线粒体内最主要的分子伴侣蛋白之一,它与HSP10组成的高分子量聚合物被形容为“巨型呼吸器”,是线粒体基质蛋白折叠和修复系统的关键组成部分。人类HSP60与其分子伴侣HSP10的基因头对头位于2号染色体上,两个基因之间有双向启动子,启动子中则含有热休克元件,接受热休克转录因子的调控[15]。正常条件下,HSP60以稳定状态存在于细胞质和线粒体基质中,维护抗凋亡因子的正常构象和功能;应激条件下,HSP60迅速从胞质中转移到线粒体基质以修复线粒体基质中的变性蛋白,对促凋亡因子产生保护和协同作用[16]。因此,HSP60有抗凋亡和促凋亡的双向调整作用。它的这种抑制或者促进作用可能与细胞种类、所受刺激类型、细胞状态、HSP60含量和活性等多种因素有关。HSP60 是一种T细胞信号,压抑或禁止化学反应,其中Peptide (p277) 是它的一个24个氨基酸片段,首先在非肥胖型糖尿病大鼠体内发现的一种抗原,p277能阻止先天的或适应性T细胞受体对B 细胞的损害,从而对1型糖尿病有治疗作用[17]。

sHSP:小热休克蛋白(small heat shock protein,sHSP)几乎存在于所有生物体中,其主要结构是由N端域和C端域2个部分组成,C端域含有一个相当保守的α晶体蛋白(α-crystallin)结构域,由约90个氨基酸残基组成,与其相邻的是可变的N端域。小热休克蛋白家族成员的共同特点是特殊丝氨酸残基上的磷酸化,磷酸化作用会导致sHSP低聚体状态发生改变,从而使sHSP的生物学功能得以发挥[18]。目前研究最多的sHSP有HSP47和HSP27。 HSP47是内质网内唯一的一种热休克蛋白,它是一种能与多种类型胶原和前胶原特异性结合的内质网驻留蛋白。在胶原合成及纤维化病理过程中发挥重要作用。国外有多项研究证实,抑制HSP47的表达,可抑制胶原合成,减弱纤维化程度[19-20]。HSP27为ATP非依赖性分子伴侣,其功能主要是防止蛋白质聚集. HSP27既可以维持细胞氧化还原稳态又可以维持线粒体的稳定性,结合和稳定肌动蛋白维持肌动蛋白网状系统的完整性,防止凋亡因子如激活的Bid进入线粒体膜。

HSPs与针灸、中药。HSPs对机体具有保护作用,故设法寻找一种没有毒副反应的HSPs诱导剂或方法,诱导HSPs合成,增加机体对细胞的保护过程,已成为国内外研究的活跃领域。中医中的针灸和中药能影响HSPs的表达。在机体受到疾病损伤时,用对机体没有损伤的针灸和中药诱导HSPs的表达,对机体产生保护作用。

祖国医学认为针刺作为一种刺激,作用于腧穴,通过经络系统的传导,调节机体脏腑功能,具有温通经络,消瘀散结,祛散阴寒,益气升陷,回阳救逆及保健强身,预防疾病等作用,已得到国内外医学界的公认[21]。临床上,刺血疗法治疗类风湿性关节炎具有镇痛和泻热作用显著的特点,用三棱针在大鼠患侧“昆仑”穴刺血,这种物理性刺激可以直接刺激机体促进HSP70的产生,增强HSP70表达。HSP70的增高又抑制炎症细胞因子如IL-1、PGE2的转录,使之减少分泌并降低循环中的含量[22]。对心脏手术者取双侧内关、列缺、云门穴位针刺,发现针刺对心肌细胞HSPmRNA基因表达有一定的增强作用,表明针刺对心脏手术者的心肌缺血有一定保护作用。刘志彬等对慢性脊髓损伤大鼠模型使用电针治疗后,通过增加HSP70的表达能量显著降低iNOS的活性,保护脊髓神细胞并减轻继发性脊髓损伤[23]。

艾灸是将艾叶点燃后放置在腧穴或病变部位进行烧灼和熏熨,借其温热刺激及药物作用以防治疾病的一种外治方法。艾灸具有镇痛、改善血循环、调整代谢紊乱、调节免疫功能和调整脏腑功能等作用。《医学入门》说:“虚者灸之使火气以助元气也,实者灸之使实部随火气发散也,寒者灸之使其气复温也,热者灸之引郁热外发”。易受乡等[24-26]对应激性胃溃疡大鼠艾灸“足三里”“梁门”穴。研究结果显示,与艾灸非穴对照点组比较,艾灸足三里、梁门穴组大鼠胃黏膜的HSP70家族的表达均明显增强、MDA含量明显减少胃黏膜损伤程度明显减轻,显著降低了应激性溃疡指数和溃疡面积比,并使应激模型大鼠的死亡率降低。

中药复方或单味药物的提取物能提高HSPs在机体的表达。于泽等[27]用三七五参汤作用与心肌缺血损伤的试验中,Western和免疫组化结果显示三七五参汤组大鼠心肌组织中HSP70的表达较正常组和模型组明显为高,心肌损伤程度明显减轻,说明三七五参汤对缺血心肌的保护作用可能与其诱发HSP70表达有关。涂胜豪等[28]观察雷公藤甲素对胶原诱导的关节炎大鼠的作用。结果发现,雷公藤甲素可以有效地下调模型大鼠关节滑膜和软骨细胞异常表达的HSP60、HSP70和MHC-Ⅰ类分子。在脑缺血再灌注中,分别用补阳还五汤、黄芪、川芎嗪、葛根素、丹参、复方阿魏酸来诱导HSP70,结果显示,虽然这些药物的作用机理不同,但是都使HSP70mRNA及蛋白表达明显增强,对脑缺血损伤有保护作用。补阳还五汤可明显抑制HSP70的转录,而黄芪则除了可明显抑制其转录外,还可轻度降低HSP70的翻译[29]。

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热休克蛋白篇2

【摘要】

【目的】观察慢性胃炎患者胃黏膜炎症改变和热休克蛋白70(hsp70)、核因子κb(nfκb)及其下游炎症因子白细胞介素8（il8）、肿瘤坏死因子α（tnfα）蛋白水平的表达,并以脾气虚证为对照,探讨脾胃湿热证与hsp70及nfκb炎症通路表达的关系。【方法】临床收集慢性胃炎患者51例(包括脾胃湿热证36例、脾气虚证15例),另招募正常志愿者8例作为正常对照组。胃镜下取胃窦黏膜,采用苏木素—伊红（he）染色检测炎症改变,快速尿素酶和美蓝法检测幽门螺杆菌(hp)感染,抗生蛋白链菌素—生物素免疫组织化学法检测各组hsp70、nfκb、il8及tnfα蛋白水平表达。【结果】脾胃湿热证与脾气虚证hp感染率相当,但脾胃湿热证hp感染程度及炎症程度均较脾气虚证明显,尤以脾胃湿热证hp阳性患者炎症程度最重；胃黏膜炎症程度及活动度与hp感染呈正相关。脾胃湿热证患者hsp70、nfκb、il8及tnfα表达均较脾气虚证显著升高(p ＜0.05)。从hp感染与hsp70及nfκb炎症通路情况看,脾胃湿热证hp阳性患者hsp70、nfκb表达显著高于hp阴性患者(p ＜0.05)；尽管脾胃湿热证hp阳性患者il8、tnfα表达与hp阴性患者之间的差异无显著性意义,但也呈增高趋势。wWw.133229.COm胃黏膜hp感染与hsp70、nfκb及il8表达呈一定程度的正相关,但与tnfα表达无明显相关性。【结论】慢性胃炎脾胃湿热证的发生与胃黏膜hsp70及nfκb炎症通路的表达相关。hsp70与nfκb及其下游炎症因子在胃黏膜的过表达可能部分体现了慢性胃炎脾胃湿热证“邪正交争”的亢奋状态；相比之下,慢性胃炎脾胃湿热证hp阳性患者“邪正交争”更为剧烈。

【关键词】 慢性胃炎；脾胃湿热；脾气虚；胃黏膜/病理学

abstract: objectiveto observe inflammatory changes and expression levels of heat shock protein 70 (hsp70) and nuclear factorkappa b (nfκb) as well as the correlated inflammatory factors of interleukin 8 (il8) and tumor necrosis factor alpha (tnfα) in gastric mucosa of chronic gastritis patients, and to explore the relationship of spleenstomach dampheat syndrome with hsp70 and nfκb inflammatory pathway. methodsfiftyone chronic gastritis patients were enrolled into the study. of them, 36 patients were classified into spleenstomach dampheat syndrome and 15 into spleenqi deficiency syndrome. eight healthy volunteers served as the control. gastric mucosa was sampled under gastroscope. he staining was applied for the inflammatory changes of gastric mucosa. helicobacter pylori (hp) infection of gastric mucosa was detected by fast urea enzyme and methylene blue method. the protein expression of hsp70, nfκb, il8 and tnfα in gastric mucosa was detected by streptavidinbiotin complex(sabc) immunohistochemical method. resultsthe gastric mucosal hp infection rate in patients with spleenstomach dampheat syndrome was similar to that in patients with spleenqi syndrome. however, patients with spleenstomach dampheat syndrome had severer hp infection and inflammatory changes than those in patients with spleenqi syndrome. the inflammatory changes were more obvious in spleenstomach dampheat patients with hp infection positive. the inflammatory degree and activity of gastric mucosa was positively correlated with hp infection. the protein expression level of hsp70, nfκb, il8 and tnfα in gastric mucosa of patients with spleenstomach dampheat syndrome was higher than that in patients with spleenqi deficiency syndrome（p＜0.05）. in regards of relationship of hp infection with the condition of hsp70 and nfκb inflammatory pathway, spleenstomach dampheat syndrome patients with hp positive had higher hsp70 and nfκb expression levels than those with hp negative (p＜0.05). the expression of il8 and tnfα showed an increasing trend in spleenstomach dampheat syndrome patients with hp positive as compared with that in hp negative patients, but the difference was insignificant. gastric mucosal hp infection was positively correlated with hsp70, nfκb and il8 expression to some extent, while was not correlated with the expression of tnfα. conclusionthe occurrence of spleenstomach dampheat chronic gastritis is related with hsp70 and nfκb inflammatory pathway of gastric mucosa. the overexpression of gastric mucosal hsp70 and nfκb and their associated inflammatory factors maybe partially reflect the excited state of the struggling of healthy qi or pathogenic qi in spleenstomach dampheat chronic gastritis patients, which is more obvious in those patients with hp positive.

key words: chronic gastritis; spleenstomach dampheat;

作为内源性保护蛋白,热休克蛋白70(heat shock protein70,hsp70)对维持胃黏膜的完整有重要作用［1］，核因子κb(nuclear factor κb,nfκb)活化后的表达与胃黏膜炎症密切相关［2］。本研究以hsp70及nfκb炎症通路的表达为切入点,并以脾气虚证为对照,探讨慢性胃炎脾胃湿热证发生的生物学机制，现报道如下。

1资料与方法

1.1病例资料收集2007年6月至10月就诊于广州中医药大学第一附属医院消化内科门诊属于慢性胃炎患者51例，辨证为脾胃湿热证者36例,其中幽门螺杆菌(helicobacter pylori,hp)感染阳性者19例,hp阴性者17例；男23例,女13例；平均年龄为(35.36±5.70)岁；平均病程为(1.90±1.00)年。辨证为脾气虚证者15例,男5例,女10例；平均年龄为(33.31±7.35)岁；平均病程为(2.17±0.77)年。另招募正常志愿者8例作为正常对照组，男3例,女5例；平均年龄(31.88±2.23)岁。3组在性别、年龄以及脾胃湿热证与脾气虚证患者的病程之间差异均无显著性意义(p>0.05)。

1.2诊断标准慢性胃炎的诊断采用中华医学会消化病学学会制定的《全国慢性胃炎研讨会共识意见》中的标准［3］，脾胃湿热证和脾气虚证的辨证诊断参照《中药新药临床研究指导原则》(试行)标准［4］，hp感染判断参照2003桐城会议标准［5］。

1.3纳入标准符合上述诊断标准，年龄在18~50岁之间，自愿且能够配合参加试验的受试者,并签署知情同意书。

1.4排除标准不符合上述诊断标准者；近1个月内使用过抗生素、铋剂、h2受体拮抗剂及质子泵抑制剂治疗者；合并消化性溃疡、萎缩性胃炎、食管炎、食管静脉曲张、肝炎、肝硬化等消化系统疾病者；合并有严重心、肝、肾、肺系等疾病者及孕妇、哺乳期妇女；年龄在50岁以上或18岁以下者。

1.5主要试剂及仪器鼠抗人hsp70单克隆抗体（由北京中杉金桥生物有限公司提供，批号:77091220),鼠抗人nfκb/p65单克隆抗体（购自美国santa cruz公司，批号:sc8008),兔抗人白细胞介素8（il8）亲和纯化抗体（由博士德生物工程有限公司提供，批号：ba0996),兔抗人多克隆抗体肿瘤坏死因子α（tnfα）（购自北京博奥森公司，批号:bs0078r),gifxq240型电子胃镜及bx50f3双目显微镜(附带自动照相装置nikon e990)均由日本奥林巴斯公司提供。

1.6问卷调查各组受试对象均完成临床观察表,由专人询问,对症状进行评定计分并填写表格。为准确记录患者症状,对于不容易准确判断的舌象、脉象,均由2位以上有经验的医师复核。

1.7标本收集各组受试对象均行胃镜检查,于胃窦距幽门2～3 cm处的大弯和小弯钳取胃黏膜组织共2块,1块立即进行hp快速尿素酶和美蓝法检测，1块放入40 g/l多聚甲醛中固定,石蜡包埋，行胃黏膜炎症、hp感染病理组织学及上述各指标免疫组织化学标记检测。

1.8指标检测

1.8.1胃黏膜炎症检测采用常规苏木素—伊红（he）染色方法进行。胃黏膜炎症程度、活动度的判断采用文献［3］标准,由2位病理医师在同一设定条件和未知病理诊断情况下进行。

1.8.2胃黏膜hp感染检测采用快速尿素酶和美蓝法进行,两种方法检测均呈阳性者判断为hp感染阳性,而均呈阴性者判断为hp阴性,一阴一阳者不纳入结果分析。

1.8.3胃黏膜hsp70及nfκb通路的检测采用抗生蛋白链菌素—生物素(streptavidinbiotin complex, sabc)免疫组织化学标记方法进行。hsp70、nfκb、il8及tnfα一抗的工作浓度为1∶100,并于4℃过夜,其他具体操作步骤按试剂盒说明书进行。胃黏膜上述指标表达染色指数的观察采用北航图像分析系统3000进行病理图像分析。染色指数（i染色）计算：染色指数＝染色强度×染色面积；按显色强弱记录为：阴性-0,弱阳性-1,阳性-2,强阳性-3；染色面积比为染色细胞数占总体细胞数的百分比。

1.9统计学方法采用spss for windows 16.0统计软件包进行数据的分析。以均数±标准差（±s）表示,组间均数比较用t检验；多组间计量资料比较用方差分析,等级资料用秩和检验；相关分析用spearman等级相关分析方法。显著水平设α＝0.05。

2结果

2.1各组hp感染与胃黏膜炎症程度、活动度的情况脾胃湿热证患者黏液糊大多量偏多而浊,部分伴糜烂或黏膜下出血点；其胃黏膜充血水肿及炎症程度均重于脾气虚证,但炎症活动度则2组之间未见明显差异。脾胃湿热证与脾气虚证患者胃黏膜hp感染率相当,分别为52.78%和53.33%,但脾胃湿热hp阳性患者炎症程度及活动度均较hp阴性患者明显,胃黏膜炎症程度及活动度与hp感染的相关系数分别为0.608和0.620,呈正相关；hp阳性患者胃黏膜除固有层炎症细胞浸润、上皮破坏外,部分还可见淋巴滤泡形成。结果见表1~表4及图1~图2（见彩图页第669页）。表1各组胃黏膜的炎症程度（略）表2脾胃湿热证hp感染与胃黏膜炎症程度的关系（略）表3各组胃黏膜的炎症活动度（略）表4脾胃湿热证hp感染与胃黏膜炎症活动度的关系（略）

2.2各组胃黏膜hsp70及nfκb炎症通路的表达脾胃湿热证和脾气虚证患者hsp70、nfκb及il8蛋白水平的表达定位于胃黏膜上皮、腺体及固有膜细胞的胞核和胞浆,tnfα蛋白水平的表达主要定位于胃黏膜上皮、腺体及固有膜细胞的胞浆；正常对照组各指标的表达主要定位于胃黏膜上皮、腺体及固有膜细胞的胞浆。脾胃湿热证患者hsp70、nfκb、il8及tnfα表达均显著高于脾气虚证组(p ＜0.05)。从hp感染与hsp70及nfκb炎症通路情况看,脾胃湿热证hp阳性患者hsp70、nfκb表达显著高于hp阴性患者(p ＜0.05)；尽管il8、tnfα表达与hp阴性患者之间未见显著差异,但其表达也呈增高趋势。本研究病例胃黏膜hp感染程度与hsp70、nfκb及il8表达的相关系数分别为0.322、0.288和0.277,呈一定程度正相关；与tnfα表达的相关系数为0.064,未见明显的相关性。结果见表5、表6及图3~图6（见彩图页第670页）。表5各组胃黏膜hsp70、nfκb、il8及tnfα免疫组化的表达比较(略)表6脾胃湿热证hp感染与胃黏膜hsp70、nfκb、il8及tnfα表达的关系(略)

3讨论

hp是造成胃黏膜损伤的主要攻击因子之一,与慢性胃炎、溃疡甚至胃癌均具有明确的病因学联系［6－7］。作为重要的转录调控因子,nfκb活化入核后能与炎症反应基因启动子部位的κb位点特异性结合,启动和调节相关炎症基因转录,在炎症反应细胞因子网络调节通路中起重要作用。研究显示,hp感染易导致nfκb活化，而随着nfκb活化后在胃黏膜表达的增加,炎症性细胞因子il8及tnfα表达也逐渐上升，且后者还可进一步促进nfκb的活化,产生级联反应,从而使炎症持续和放大［2,7－8］，这与中医认为“湿热邪气”具有熏蒸、粘滞以及致病隐匿、渐进和缠绵易反复的特点较类似。

众所周知,中医在强调“邪气”致病的同时,往往更加注重机体“正气”的御邪能力。作为内源性保护蛋白,hsp70在维持胃黏膜的完整中有着重要作用［1］。已有研究发现,hp阳性患者胃黏膜hsp70表达随hp感染程度的加重而增强［9］；hsp70可通过nfκb通路调节脂多糖所诱导的炎症性细胞因子的表达［10］。笔者于此也曾提出hp感染可能通过激活nfκb通路,使相关炎症因子过表达而致病，而hsp70则可能通过介导细胞保护,阻止nfκb活化从而能一定程度提高胃黏膜对hp和相关炎症因子的防御和耐受能力的观点［11］。本课题组近期mrna水平定量研究也提示,慢性胃炎脾胃湿热证患者胃黏膜hsp70及nfκb的表达明显高于脾气虚证组和正常对照组［12］。

从本研究病例看,慢性胃炎脾胃湿热证与脾气虚证hp感染率相当,但脾胃湿热证hp感染程度及胃黏膜炎症程度较脾气虚证为重,尤其以脾胃湿热证hp阳性患者的炎症程度最重。脾胃湿热证和脾气虚证组患者胃黏膜hsp70与nfκb及其下游炎症因子il8、tnfα蛋白水平的表达分别较正常对照组升高和下降；与正常对照组仅呈胞浆未活化状态的表达不同,2组hsp70、nfκb及其il8均呈胃黏膜上皮、腺体和固有膜活化后细胞核和胞浆的同时表达,且2组之间的表达存在着显著性差异，一定程度体现了脾胃湿热证邪气亢盛与正气奋起抗邪以及脾气虚证正虚体弱不足以奋起抗邪的特点。从与hp感染的相关性来看,胃黏膜炎症程度和活动度以及hsp70、nfκb及其炎症因子il8表达均与hp感染程度呈一定的正相关；但tnfα表达与hp感染程度未见明显相关性,是否与tnfα体内效应呈表达量依赖性有关,尚待进一步的探讨。

上述研究初步提示,慢性胃炎脾胃湿热证的发生与hsp70和nfκb及其炎症通路相关；相对而言,hp阳性脾胃湿热证患者的炎症反应最为明显；具有胃黏膜保护作用的hsp70可能部分体现了机体正气的作用,而nfκb及其下游炎症因子则可能部分体现了体内邪气的力量。根据hp的致病性、hsp70本身的特点及其在本研究病例中医证候的表达,结合前期的相关研究,本研究进一步提出hp可能属中医“湿热邪气”,而hsp70可能属“正气”范畴的观点；并初步认为hsp70与nfκb及其下游炎症因子在胃黏膜的过表达可能部分体现了慢性胃炎脾胃湿热证“邪正交争”的亢奋状态；相比之下,慢性胃炎脾胃湿热证hp阳性患者“邪正交争”更为剧烈。

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热休克蛋白篇3

【关键词】 热休克蛋白70 葡萄糖调节蛋白94 免疫球蛋白G 肺癌 共定位

热休克蛋白(heat shock proteins， Hsp)是一组高度保守的且具有重要生理功能的蛋白质分子， 在一些应激状态下可被诱导表达。研究表明多种肿瘤细胞都有Hsp70的表达， Hsp70的表达和肿瘤细胞的生长和发展可能存在相关性[1， 2]。内质网分子伴侣Grp94属于Hsp90家族。肿瘤细胞中Grp94的表达增加与细胞的生长存在密切的关系， Grp94的过表达参与了一些肿瘤的形成[3]。IgG是机体免疫系统中的重要分子， 新近的研究发现， 上皮来源的恶性肿瘤如乳腺癌、 大肠癌、 胃癌及体外培养传代细胞等存在Ig或Ig样物质[4]。但是， 目前关于三者在肺癌组织中共表达及相互定位关系的意义报道较少， 本研究通过探讨Hsp70、 Grp94、 IgG在肺癌组织中的表达及相互的定位关系， 为进一步研究肿瘤自身免疫机制和肿瘤的免疫治疗、 肿瘤疫苗开发提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

肺癌40例组织标本(2005/2006年患者， 男28例， 女12例， 年龄37～76岁， 平均59岁）取自第四军医大学西京医院病理科（临床及病理明确诊断为肺癌的活检组织块）。小鼠抗Grp94单克隆抗体（mAb）、 小鼠抗Hsp70 mAb、 小鼠抗IgG mAb、 HRPIgG二抗（羊抗小鼠)、 兔抗IgG多克隆抗体、 荧光抗体FITCIgG（羊抗兔）、 Texas RedIgG（羊抗小鼠）均为DAKO公司产品。DAB显色试剂盒为Sigma公司产品。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色

组织用100 g/L甲醛固定， 石蜡包埋， 做成组织芯片。常规脱蜡至水。组织抗原微波修复10 min。冷却至常温。用10 mL/L过氧化氢室温孵育10 min， 封闭内源性过氧化物酶， 用PBS缓冲液（pH7.4）振洗3次， 每次5 min， 正常羊血清封闭。加一抗(小鼠抗Hsp70 mAb 1∶100， 小鼠抗Grp94 mAb 1∶100， 小鼠抗IgG mAb 1∶100)， 37℃孵育1 h， 用PBS液冲洗3次， 每次5 min， 再加HRPIgG二抗（羊抗小鼠)， 37℃孵育1 h， 再用PBS液冲洗3次， 每次5 min。经H2O2DAB (5 mL PBS pH7.4， DAB 5 μg， H2O21 mL)在显微镜下控制显色， 苏木素复染套核， 脱水、 透明及封片。以肿瘤细胞中出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。

1.2.2 免疫荧光双标记和激光共聚焦显微镜观察

切片常规脱蜡至水。组织抗原微波修复（柠檬酸盐修复液）。正常羊血清封闭。加一抗(小鼠抗Hsp70 mAb 1∶100， 小鼠抗Grp94 mAb 1∶100， 兔抗IgG多抗1∶100)， 37℃孵育1 h， 用PBS液冲洗3次， 每次5 min。再加荧光二抗（羊抗兔FITCIgG 1∶200， 羊抗鼠Texas redIgG 1∶200)， 37℃孵育1 h， 再用PBS液冲洗3次， 每次5 min。甘油封片。激光共聚焦显微镜观察并采图。

1.2.3 图像分析及统计学处理 图像采用Imagepro plus5.1分析系统分析。显微镜下每块组织取上下左右中5个显微镜视野采图， 图像分析系统分析每个视野的积分光密度值（IOD）， 然后求平均IOD值。结果采用SPSS11.0统计软件进行统计学处理。

2 结果

2.1 免疫组织化学染色

Hsp70、 Grp94、 IgG在肺癌组织中阳性反应产物为棕黄色颗粒。本实验结果显示肺癌组织中Hsp70、 Grp94、 IgG都

有高表达。Hsp70阳性率为65%（26/40）， 平均光密度值为5.10±0.32（图1）， 胞核、 胞质都有阳性反应产物（图2）。Grp94阳性率为45%（18/40）， 平均光密度值为3.52±0.35（图1）， 阳性定位主要在胞质（图2）。IgG阳性率为82.5%（33/40）， 平均光密度值为8.12±0.31（图1）， 阳性定位主要在胞质（图2）。

2.2 免疫荧光双标染色及激光共聚焦显微镜观察 镜下明亮的绿色荧光(FITC)显示肺癌组织中IgG， 荧光主要定位在胞质中（图3）; 红色荧光(Texas Red)显示肺癌组织中的Hsp70、 Grp94， Hsp70荧光胞核胞质都有， Grp94荧光主要定位在胞质中（图3）; 黄色荧光显示IgG与Hsp70、 Grp94存在共定位关系（图3）。26例Hsp70染色阳性的肺癌病例中有10例与IgG存在共定位关系， 18例Grp94与IgG存在共定位关系（图3）。

3 讨论

大量研究表明， Hsp在肿瘤组织中呈高水平表达。本研究发现Hsp70 Grp94 在肺癌组织中也是高表达的。新近研究发现Hsp与肿瘤关系密切， 可与癌基因、 抑癌基因及其产物相互作用调节肿瘤细胞的增殖和异型分化[5， 6]。且Hsp70与原癌基因crnyc、

抑癌基因p53关系密切[7]。Abdel等[8]报道， Hsp70与cmyc蛋白、 p53蛋白的结合抑制了Hsp70与靶分子MHCI类分子的结合， 从而阻止MHCI类分子细胞表面的转运和表达及向NK细胞和T淋巴细胞提呈肿瘤特异性抗原， 这可能是肿瘤细胞的免疫逃逸机制之一。成瘤细胞合成大量的Grp94的能力使其能抵抗具有免疫活性宿主的不利条件而获得成瘤性。有资料显示Grp94与人肺癌的发生发展有关。Grp94表达的升高可能是人肺癌的一个特征[9]。Grp94在肿瘤细胞中作为主要的肿瘤排斥抗原， 引发针对该肿瘤细胞的特异性免疫反应。已证实提取的Hsp70和Grp94具有分子伴侣和免疫佐剂

效应， 能够相伴肿瘤抗原肽， 激活免疫细胞特异性攻击肿瘤细胞[10， 11]。抗瘤机制在于其作为伴侣促进抗原肽在MHC I类分子的承载， 因而增强了肿瘤抗原肽在MHC I类分子上的提呈[11]。而且Hsp70或Grp94相伴肽还可以作为超抗原直接激活T淋巴细胞或自然杀伤细胞而不用依赖刺激MHC I类分子[12]。通过这些方式诱导CTL细胞毒反应和激活抗瘤免疫效应。

IgG是免疫系统中的重要分子， 经典的免疫学理论认为， 免疫球蛋白是B淋巴细胞的特征产物。而有研究表明上皮性肿瘤也能分泌IgG且可促进瘤细胞的生长[13]。这是传统免疫学所面临的一个新问题。有学者用各种方法证实多种上皮源性肿瘤细胞可以衍生IgG样物质。反义的寡核苷酸阻止IgG的表达在体外可以抑制肿瘤细胞的生长; 抗IgG抗体可以诱导分泌IgG的肿瘤细胞退化; 结果也间接显示IgG可能促进肿瘤细胞的生长[4]。这可能揭示了一种新的肿瘤细胞生长机制并发现了一个新的调控肿瘤细胞生长进化的靶点。本研究发现肺癌组织中的IgG表达阳性率及阳性强度较高， 提示IgG的表达在肺癌的发生发展过程中的普遍存在。发展针对肿瘤来源IgG的选择性阻滞剂可能是一种新的肿瘤免疫治疗的方法。

实验中发现， IgG和Hsp70、 Grp94的免疫组化染色表现非常相似， 2005年我们曾发现在肝癌细胞中IgG和Hsp70这2个重要分子存在共定位[14]。本实验不仅进一步揭示了Hsp70和IgG有共定位关系， 而且还发现Grp94和IgG也存在一定的共定位关系。这可能是某些肿瘤发生、 发展的机制之一。提示Hsp70、 Grp94和IgG在肿瘤的发生、 发展中具有协同作用， 或者肺癌组织中可能有Grp94IgG、 Hsp70IgG或Hsp70IgGGrp94的复合物的存在。其共同作用于肿瘤发生发展的某一环节， 参与肿瘤的自身免疫防御和免疫逃逸。肿瘤细胞中免疫复合物的形成可能保护肿瘤细胞免受免疫攻击而促进肿瘤细胞的生长。但具体的作用机制需要进一步的探索。

参考文献

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热休克蛋白篇4

【关键词】  热休克蛋白60 树突状细胞 动脉粥样硬化 表型 细胞因子

effect of heat shock protein 60 on murine dendritic cell function in vitro

wu wei, li dazhu, zhou you, zeng qiutang.

department of cardiology, union hospital, tongji medical college, huazhong university of science and technology, wuhan 430022, china

［abstract］  objective:to investigate the effect of heat shock protein 60(hsp60), significant inflammatory factor in atherosclerosis, on the maturation of murine dendritic cells(mdcs) in vitro.methods:myeloid mdcs were extracted in vitro from mouse marrow and incubated to mature with two distinct concentrations of mhsp60.the morphological changes were observed;the variation of phenotype was detected with flow cytometric analysis; the stimulating capacity was determined in allogenic mixed lymphocyte reaction(mlr); elisa was used to analyze the level of cytokines secreted by mdcs and stimulated lymphocyte in the medium of mlr.results:dendrites of mhsp60dcs raised obviously. the expression of costimulating factor cd11c+, cd86, cd80 was upregulated. the stimulating capacity of mhspdcs in mlr was higher. t lymphocytes cocultured with mhspdcs in mlr secreted higher levels of proinflammation cytokines(ifnγ, il12) but there were no significant difference of il4, the stimulatory action was dose dependent and was evident at higher concentrations. the ratio of ifnγ/il4 was increased.conclusion:mhsp60 progressed the maturation of mdc dosedependently in vitro.

   

［key words］  heat shock protein 60；dendritic cells；atherosclerosis；phenotype；cytokines

   

研究表明，动脉粥样硬化（atherosclerosis, as）的发生和发展与炎症免疫反应密切相关。树突状细胞（dendritic cells ,dc）作为最强的专职抗原提呈细胞能有效刺激初始t细胞对异体及自身抗原产生免疫应答，维持免疫平衡［1］。许多证据证明dc聚集在粥样斑块的局部，冠心病者循环亦存在dc激活的证据，提示dc在动脉粥样硬化的炎性反应中起重要作用。动脉粥样硬化时dc的激活抗原尚不清楚［2］。已知动脉粥样硬化斑块中存在热休克蛋白(heat shock protein, hsp)60，冠心病者循环中存在抗hsp60抗体，故认为hsp60是动脉粥样硬化的相关抗原之一［3］。hsp60对dc的作用国内尚无报道，本文探讨其对小鼠dc成熟和免疫功能的影响。

1  材料与方法

1.1  材料及主要试剂  10周龄雄性c57bl/6j鼠购自北京维通利华实验动物有限公司；rmgmcsf和rmil4购自biosource公司；fitcanti mouse cd11c+、peanti mouse cd80及peanti mouse cd86购自biolegend公司；mhsp60购自stressgen公司；il4、ifnγ、il12 elisa试剂盒购自r&d公司。完全培养基包括：rpmi1640(gibco公司)，20%胎牛血清(gibco公司)，青霉素100 u/ml，链霉素100 u/ml，20 ng/ml rmgmcsf，20 ng/ml rmil4。

1.2  方法

1.2.1  小鼠骨髓dc培养  参照文献［4］方法稍做改进。简言之，取小鼠股骨和胫骨，去掉骨两端，用5 ml注射器吸取rpmi1640液冲洗髓腔，收集所得液体，200目尼龙网过滤后，trisnh4cl溶解红细胞，细胞悬于20%胎牛血清rpmi1640培养液中，种植于50 ml培养瓶中，置于37℃、5%co2孵育箱中，过夜后，弃去悬浮细胞，再加3 ml新鲜完全培养基，37℃、5%co2温箱培养，隔天半量换液，每次换液均保留细胞悬液直至第9天。

1.2.2  实验分组及细胞处理  将培养第9天的细胞分为3组：①对照组：培养液加pbs；②高剂量组：培养液加mhsp60 10 μg/ml；③低剂量组：培养液加mhsp60 3 μg/ml。3组均孵育24小时后保留细胞悬液。

1.2.3  形态观察  培养3、5、9和10天，用倒置显微镜，电镜和fitcanti cd11c+荧光染色后在荧光显微镜下观察dc形态。

1.2.4  流式细胞仪检测（fasc）  收集细胞调整密度为1×106 ml-1，每管为100 μl，加入标记抗体fitccd11c+、pecd80及pecd86，各0.1 μg，4℃孵育20分钟，pbs洗2遍，加入0.5 ml pbs重悬，美国becton dickinson公司流式细胞仪双标检测mdc的表型，以cd11c+设门，cellquest软件分析。

1.2.5  同种混合淋巴反应（mlr）  取近交系balb/c小鼠脾脏匀浆过滤后，去除红细胞培养2～3小时后取悬浮细胞，即淋巴细胞作为反应细胞。调整淋巴细胞为105/孔，mdc为104/孔，在96孔培养板中37℃、5%co2孵育96小时，取上清液保存，-70℃测细胞因子；再于每孔中加入mtt 20 μl，混匀后，37℃、5%co2孵育4小时，加dmso溶解后，560 nm波长检测a值。

1.2.6  细胞因子的检测  按照elisa试剂盒说明检测细胞培养液及mlr的上清液中il4、ifnγ和il12水平。以加pbs的细胞悬液为对照组，mhsp60孵育后的细胞悬液为处理组，并按浓度不同分为2组。

1.2.7  统计分析  使用spss 10.5统计软件统计分析。数据用x±s表示，组间比较用t检验。

2  结果

2.1  dc形态观察

2.1.1  倒置显微镜下观察  培养第3天可见细胞成簇生长，由圆形变为不规则形，并长出一些小刺状结构，细胞质变得丰富；培养第5天，树突样结构更加明显，胞质更加丰富；培养第9天，细胞数目增加显著，开始有部分悬浮或半贴壁；孵育后，即第10天，细胞大部分悬浮或半贴壁，少数贴壁，见图1。

2.1.2  荧光显微镜观察  处理组可见细胞成簇生长，细胞形态不规则，周边成毛刺状，低剂量与高剂量无明显差别；未处理组细胞成簇生长，细胞形态椭圆形，细胞核似蚕豆状，毛刺状不明显，见图2。

2.1.3  电镜观察  处理组细胞核呈分叶状，内吞区域多，细胞表面突起明显；未处理组细胞核圆，内吞区域少，细胞表面突起较处理组为少，见图3。

图1  倒置显微镜下观察细胞形态变化(×10)（略）

fig.1  morphologic change of mdcs by inverted microscope(×10)

note:mdcs on day 10 of culture(incubated with mhsp60).

图2  荧光显微镜观察(×40)（略）

fig.2  mdcs observed by fluorescence microscope(×40)

note:mdcs(incubated with mhsp60) stained by fluorchrome fitccd11c+.

图3  电镜观察(×4 000)（略）

fig.3  mdcs observed by electron microscope(×4 000)

note:mdcs(incubated with mhsp60) stained by transmission electron microscope.

图4  热休克蛋白对树突状细胞成熟表型的影响（略）

fig.4  hsp effect on phenotype of mdcs maturation

note:graph a and b display cd86 and cd80 expression of mdcs, respectively. graph a shows cd86 positive, 43.1% in control group, 59.7% in lowdose group and 87.2% in highdose group. graph b shows cd80 positive, 48.6% in pbs group, 63.2% in lowdose group and 76.7% in highdose group.

表1  elisa法检测细胞因子浓度（略）

tab.1  detection of cytokines concentration by elisa

note:mhsp60 group compared with control group,1) p＜0.01；lowdose group compared with highdose group,2) p＜0.01.

2.2  细胞表型检测  收集不同浓度mhsp60孵育的mdc及未加mhsp60的mdc，用流式细胞仪分析其表型cd11c+、cd80及cd86，结果显示：与对照组相比，处理组的cd80及cd86表达显著增高（p<0.01）。处理组内随mhsp60的浓度增加，cd80及cd86表达越明显，见图4。

2.3  同种混合淋巴反应  调节dc密度为5×104 ml-1时，dc刺激t淋巴细胞增殖的a值，高剂量组为6.3±2.9，低剂量组为3.8±1.6，显著高于对照组1.7±0.5(p<0.001)，说明hsp60dc刺激t淋巴细胞的能力明显增强；而高剂量组hsp60dc比低剂量组刺激能力更强(p<0.001)，说明hsp60dc刺激能力与mhsp60剂量呈正相关。

2.4  细胞因子检测  各悬液的细胞因子浓度见表1。处理组与对照组il4没有明显差别(p>0.05)；处理组的il12与ifnγ显著高于对照组（p<0.01），而高剂量组又较低剂量组浓度高（p<0.01）。il4/ifnγ比值处理组明显高于对照组(p<0.01)，而处理组内仍有差别（p<0.01），提示mhsp60使mdc刺激的免疫类型以细胞免疫为主，即产生免疫偏移。

3  讨论

   

动脉粥样硬化明确的病理过程尚不清楚，但目前认为其起始、发展与免疫炎症密切相关。树突状细胞作为体内最强的抗原提呈细胞，是免疫反应起始及发展的关键。初始t淋巴细胞必须与之接触后，通过mhc抗原的识别和cd80(b71)、cd86(b72)等共刺激分子的配对及某些细胞因子的作用才能激活，发挥生物学效应。我们以往证实动脉粥样硬化病人循环中dc的功能是增强的，且在体外应用不稳定型心绞痛一线药物阿托伐他汀后，dc的功能明显抑制［5，6］；而bobryshev等［7］亦发现了动脉粥样硬化斑块中存在dc及dc与t细胞接触的证据，肯定了dc参与动脉粥样硬化的发生及发展过程。

   

在动脉粥样硬化病理过程中dc所提呈的抗原目前认为有多种，如人巨细胞病毒、肺炎衣原体、oxldl（氧化型低密度脂蛋白）、hsp60等。而hsp60日益被重视，hsp60被认为是dc提呈的关键抗原之一。hsp是一类进化上高度保守的分子，细菌与人的hsp存在高度同源性。因而某些细菌感染后，dc细胞提呈细菌hsp65于t淋巴细胞所产生的抗体与人hsp60可能存在交叉反应，近年来这已在多种自身免疫疾病研究中得到证实［8］。同时研究表明病人血浆hsp60抗体滴度水平与冠心病发生存在相关性，血清抗分枝杆菌hsp65抗体在冠状动脉粥样硬化、血管炎、心肌缺血以及ptca术后狭窄患者中明显升高，且抗体水平升高可提示严重动脉粥样硬化的预后［3］。最近已有报道急性冠状动脉综合征病人的体内存在hsp60特异性t细胞，因而认为由于dc在细菌hsp65和人的hsp60之间存在交叉识别，某些细菌感染后dc摄取处理hsp65后呈递于初始t淋巴细胞，使之激活，而致敏t细胞通过交叉识别可能对自身血管内皮细胞产生免疫损伤，引起炎症反应，在动脉粥样硬化病人中则会引起粥样斑块增生和不稳定［9］。但是目前hsp60对dc的功能影响尚无报道，本研究在体外探讨了hsp60对dc的功能影响。

   

本研究中证实了hsp60在体外可以显著地提高dc免疫功能，表现在hsp60孵育后的dc共刺激分子cd86、cd80表达增加，抗原呈递功能增强，促使t淋巴细胞增殖及分泌细胞因子il12、ifnγ能力提高。值得注意的是，dc免疫功能的提高是hsp60剂量依赖性的。由于免疫过度激活是动脉粥样硬化启动因素，因而在斑块局部抑制hsp60/65激活dc，减少免疫炎性损伤，可能会起到抑制斑块增生和稳定斑块的作用，为预防或治疗动脉粥样硬化相关疾病提供新的思路。

【参考文献】

 

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热休克蛋白篇5

【关键词】 人参皂甙Rb1；应激；热休克蛋白质70；蛋白激酶C

Abstract： ［Objective］ To study the effect of ginsenoside Rb1 on liver heat shock protein70 and protein kinase C and the relationship between the two factors.［Methods］ 56 SD(Sprague Dawley) rats were pided into 3 groups: ginsenoside group， saline group， shamoperated group. Put these rats to death at 30min， 60min and 180min， extract liver and draw blood， use the ELISA to analyze the expression of HSP70 and the level of PKC.［Results］ (1) To compare the level of PKC at different time points of ginsenosides and the saline group，60 min ginsenoside group is higher than the saline group. There is a significant difference(P0.05). (2)To compare HSP70 at different time points of ginsenosides and the saline group， 30 min and 60 min ginsenoside groups are higher than the saline group. There is a significant difference(P0.05). (3)The linear regression analysis of the level of PKC and the expression of HSP70 show that two factors are in significant positive correlation.［Conclusions］ 1.Ginsenoside Rb1 can increase the expression of HSP70. 2.Ginsenoside Rb1 can increase the level of PKC.3.The movement of the expression of HSP70 and the level of PKC are in significant positive correlation.

Key words: ginsenoside Rb1；stress；heat shock protein70；protein kinase C

应激是指机体在受到各种强烈因素(应激原)刺激时所出现的非特异性全身反应，又称为应激反应。研究发现应激过程中产生的多种介质、应激激素和细胞因子可以通过直接或间接途径导致肝细胞的损伤和功能变化，从而影响机体的应激调节功能，进而影响机体的预后或转归。笔者于2007年7月至2008年1月，采用大鼠肝脏缺血再灌注制作应激模型，通过检测大鼠肝脏热休克蛋白70（HSP70）和蛋白激酶C（PKC）的变化，观察人参皂甙Rb1对应激时对HSP70和PKC的影响及两者的关系，从而探讨人参皂甙Rb1保护应激机体的机制是否与PKC有关。

1 材料和方法

1.1 实验动物

清洁级SD雄性大鼠56只，体重（200±15）g，由浙江中医药大学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂及仪器

人参皂甙Rb1粉针剂（上海同田生物技术有限公司）；HSP70 ELISA试剂盒、PKC ELISA试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）；全自动酶标仪:SERIAL RS232C型（浙江中医药大学生物实验室）。

1.3 实验分组及造模

将大鼠分为人参皂甙组、生理盐水组、假手术组。根据Pringle′s 改良法造模：大鼠禁食不禁水12h，人参皂甙组尾静脉注射人参皂甙Rb1 1ml/kg，生理盐水组注射生理盐水1ml/kg，30min后腹腔注射10%水合氯醛0.4ml/100g（400mg/kg）麻醉。

1.4 实验方法

250u/ml肝素钠按2～4ml/kg静脉注射全身肝素化。将大鼠平卧位固定于手术台上，手术区备皮，PVP碘消毒，铺巾。常规手术操作沿腹白线作约2.5cm的切口，暴露肝脏，轻轻游离肝动脉、门静脉、胆总管，用无创伤微血管夹夹闭肝十二指肠韧带，阻断入肝血流，造成肝脏缺血， 30 min后松开微血管夹，恢复血供。术后立即于双侧腹股沟皮下各注射1ml生理盐水，以补充术中液体丢失。操作过程中所有动物腹腔注射37℃生理盐水10ml，以保持血液动力学的稳定。术后分别于30、60、180min处死后取肝脏标本，称重0.1g左右，放入匀浆器，加入细胞裂解液1ml，0℃冰浴环境中手工匀浆至肝脏组织完全磨碎溶解。将匀浆液倒入离心管，于4℃低温离心器离心（20000rpm，20min），吸取上清液，标记后置于-80℃冰箱内冷冻保存。

1.5 观测指标及检测方法

HSP70及PKC测定：酶联免疫吸附( ELISA)法测定，试剂购自武汉华美生物工程有限公司，严格按照试剂盒说明书操作。

1.6 统计方法

应用SPSS17.0统计软件包进行统计分析处理，实验数据以x±s表示，样本均数间两两比较用q检验（SNK法）。取双侧P

2 结果

2.1 肝脏HSP70表达

模型组大鼠肝脏HSP70表达较假手术组明显增高，与假手术组比较有显著性差异（P

2.2 肝脏PKC水平

模型组大鼠肝脏PKC水平较假手术组明显增高，与假手术组比较有显著性差异（P

2.3 肝脏HSP70与PKC水平的相关性分析

静注人参皂甙大鼠肝脏PKC水平随着时间点总体变化呈V字形，而肝细胞HSP70的表达总体也呈V字形。利用SPSS17.0做出PKCHSP70拟合曲线见图1。对HSP70和PKC进行线性回归分析，结果表明： PKC 与HSP70呈显著正相关。

3 讨论

HSP是一组高度保守的蛋白质，是细胞内一种内源性具有保护作用的物质，能增强机体或细胞对于打击的耐受。其中HSP70在热休克、微生物感染及自身免疫性疾病等应激条件下具有重要的细胞保护作用［1］。HSP70对肝脏损伤的保护作用表现在：（1）氧化损伤的保护；（2）缺血再灌注的保护；（3）抗细胞凋亡；（4）抗炎作用。本研究结果显示，造模后各组大鼠肝脏HSP70 的表达先后升高，与文献报道一致［23］。PKC是属丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶的多基因超家族［4］，是肌醇磷脂系统的中心酶，它可使大量的底物磷酸化而广泛参与保护性蛋白质的合成、细胞的生长分化、细胞的分泌等作用的生理调节。Yang等［5］研究发现缺血可以促使某些内源性物质释放，这些物质包括儿茶酚胺、氧自由基、腺苷等，它们作用于细胞膜上的特异性受体，通过G蛋白的介导，激活磷脂酶C或D，使磷脂酰肌醇二磷酸或肌醇磷脂胆碱水解，引起二酰基甘油生成及细胞内Ca2+浓度增高，从而激活PKC。PKC激活后产生的保护作用是某些效应蛋白磷酸化的结果。ATP依赖的钾通道、5′核苷酸酶、热休克蛋白和丝裂素活化蛋白激酶等有可能成为PKC的底物。本研究结果显示：而大鼠PKC水平变化与HSP70的表达变化根据线性回归分析呈显著的正相关，表明人参皂甙Rb1促进HSP70表达的机制与PKC有关。

人参主补五脏，安精神，大补元气，生津止渴，可挽救气脱危症及肺虚喘促、脾虚泄泻、消渴少津等一切虚症。人参增强免疫系统功能，促进生长发育，增强动物对外部或内部因素引起功能低下的抵抗力和适应性即抗应激作用与中医滋补强壮含义是接近的。现代药理学研究表明人参是适应原性药物，具有双向调节作用。 人参的双向调节作用是指向着有利于机体功能恢复和加强的方向进行调节。 这个结论与传统中医关于人参“扶正祛邪”的作用是相符的。

综上所述，肝脏是体内代谢的中心，又是重要的免疫器官，可以影响机体的应激调节功能，进而影响机体的预后或转归。HSP70是细胞内一种内源性具有保护作用的物质，增强机体或细胞对于打击的耐受。我们的实验表明，人参皂甙Rb1可以提高应激时大鼠肝脏HSP70的表达和PKC水平提高，且HSP70的表达与PKC水平的变化呈正相关。

参考文献

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热休克蛋白篇6

[摘要]目的:研究HSP90在糖尿病性难愈创面中的作用。方法:在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠背部做d=2cm的全层皮肤缺损模型,并随机分为四组:空白组(B组)、HSP90组(C组)、胰岛素组(D组)及HSP90与胰岛素联合用药组(E组)。另设一组正常大鼠同样在背部做d=2cm全层皮肤缺损模型作为对照组(A组),每组n=(5n1+n2)=20只,共100只大鼠,在创面形成后即时给予难愈创面药物治疗持续2天,A组则不治疗。于创面形成后第3天、第5天、第7天、第10天、第14天及第21天进行大体观察及活体取材做常规病理学观察,各时间点标本采用免疫组化ABC法观察HSP90,并计算其平均密度值及积分光密度值,观察其表达规律。结果:大体观察下,在计算第21天的创面愈合率后我们发现, C组(85.9%)、D组(86.8%)及E组(96.8%)相较于B组(79.7%)创面愈合率均有显著提高(P16.7mmol/L,体重明显下降(>50g)为造模成功[4]。三天后补注STZ(以10～20mg/kg体重剂量腹腔注射),并测量FBG值。切取全层皮肤暴露肉膜为准后以d=2cm的金属环间断缝合固定于创缘,防止创面挛缩。

1.1.2 给药及分组:A组不涂抹任何药物;B组为空白药膏;C组为含有浓度1μg/ml HSP90的药膏;D组为含有浓度30μg/ml胰岛素的药膏;E组为含有1μg/ml HSP90及30μg/ml胰岛素的药膏。各给药组均以外用涂抹局部给药,药膏均匀覆盖整个创面(约1g/次)为准(含有药物的药膏均委托金花生物制药集团有限公司完成)。HSP90的浓度为我们参考了Li.W试验中用于正常创面的治疗浓度后[3],并以15只糖尿病大鼠给予1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml进行了简单的预实验,发现三种浓度的效果并无显著差异,所以取最小浓度。

6941,

2实验过程及观察设计

在创面形成后即时给予难愈创面药物治疗持续2天,A组则不治疗,动物创面予以暴露。创面的固定环会于创面形成后的第10天予以摘除,因为此时皮肤挛缩力量较大,会导致缝合线断裂,为统一标准予以摘除。并创面形成后第3天、第5天、第7天、第10天、第14天及第21天进行大体观察及活体取材做常规病理学观察,在第3天、第5天、第7天、第10天及第14天5个时间点各取n1=3个标本,而在第21天取n2=5个标本,各标本取材时取全层厚皮肤,保留创缘约1～2mm的正常皮肤。

2.1 大体观察指标:分别于用药后第3、5、7、10、14、21 进行大体拍照观察并采用ADOBE photoshop cs4 计算各时期的创面愈合率;

2.2 镜下观察指标:并于3、5、7、10、14、21天取创面标本,3、5、7、10、14天每组各时间点3只,21天时每组5只。皮肤标本剪成横断面,标本均用1%中性福尔马林固定,石蜡包埋,连续切片,分别进行HE染色、并使用ABC法进行HSP90的免疫组化染色。并采用image pro plus 6.0彩色图像分析系统, 每张切片选取5个有代表性的200倍视野,测量每个标本HSP90阳性表达密度及积分光密度IOD值的均值并记录。

2.3 数据统计:所得试验数据均采用SPSS11。文中数据以均数和标准差(x±s) 表示,并且对创面愈合率采用两个独立样本t检验进行比较。

3实验结果

热休克蛋白篇7

【摘要】 目的 观察加味小柴胡汤对顺铂诱导的大鼠肝BRL细胞核转录因子-kB(NF-kB)、热休克蛋白70(HSP70)表达的影响。方法 将BRL细胞分为4组：空白组、顺铂组及加味小柴胡汤大、小剂量组。采用完整细胞蛋白质斑点印迹、免疫组织化学等方法，检测各组细胞NF-kB、HSP70变化。结果 顺铂组NF-kB表达明显较空白组升高，HSP70表达降低，组间比较差异有统计学意义；加味小柴胡汤大、小剂量组 NF-kB明显较顺铂组低，差异有统计学意义；加味小柴胡汤大、小剂量组HSP70表达均升高，但仅加味小柴胡汤大剂量组差异明显。结论 加味小柴胡汤可下调顺铂诱导的BRL细胞NF-kB表达，上调HSP70表达，此作用可能是该方减轻细胞氧化损伤、抑制细胞凋亡重要机理之一。

【关键词】 BRL细胞；顺铂；加味小柴胡汤；细胞核转录因子-kB；热休克蛋白70

Abstract：Objective To study the effect of modified Xiaochaihu Decoction on NF-kB and HSP70 of BRL cell induced by cisplatin. Methods BRL Cells were pided into control group， cisplatin group， high and low dose of modified Xiaochaihu decoction. Complete cell protein dot blot technique and immunohistochemisth analysis were appllied to detect the change of NF-kB and HSP70. Results There was a significant increase in NF-kB and decrease in HSP70 of BRL cell induced by cisplatin compared with control group. There was a significant decrease of NF-kB in modified Xiaochaihu decoction group compared with cisplatin group. There were increases of the expression of HSP70 in both high and low dose group， but only the high dose group demonstrated significant difference. Conclution The expression of NF-kB of BRL cell induced by cisplatin can be inhibited while the expression of HSP70 can be enhenced by modified Xiaochaihu decoction. It may be one of important mechanisms of relieving cell oxidize lesion and inhibiting apoptosis by modified Xiaochaihu decoction.

Key words：BRL cell；cisplatin；modified Xiaochaihu decoction；NF-kB；HSP70

核转录因子-kB(NF-kB)是一种能与免疫球蛋白k轻链基因的增强子kB序列特异结合的蛋白因子，具有多向转录调节作用，当细胞氧化损伤后NF-kB的表达增强[1]。热休克蛋白(HSP)是机体在各种应激性侵害时所产生的一种高度保守蛋白质， HSP70是HSP中最重要的一种中等分子量蛋白，其表达能够对应激状态下细胞产生保护作用。HSP的细胞保护作用可能是恢复和维持抗氧化酶功能，修复其在应激状态时被破坏的功能蛋白，从而稳定细胞结构，使细胞维持正常的生理功能[2]。笔者利用体外细胞培养方法，观察了顺铂诱导BRL细胞应激反应损伤时NF-kB、HSP70的异常表达及加味小柴胡汤的调控作用。

1 实验材料

正常大鼠肝BRL细胞，广州中山大学动物实验中心细胞库提供。胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM、单克隆抗体、TUNEL检测试剂盒均购自Sigma公司。顺铂为齐鲁制药有限公司生产，批号0503007。加味小柴胡汤由中国人民解放军第153中心医院中药制剂室制备(原药材1 g/mL)。

2 实验方法

2.1 细胞分组及处理

取处于对数生长的BRL细胞随机分为4组(每组6瓶)。空白组：加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基；顺铂组：加入顺铂5 mg/L及10%胎牛血清的DMEM培养基；加味小柴胡汤大剂量组：加入顺铂5 mg/L、10%胎牛血清的DMEM培养基及加味小柴胡汤4 mg/mL；加味小柴胡汤小剂量组：加入顺铂5 mg/L、10%胎牛血清的DMEM培养基及加味小柴胡汤2 mg/mL。在37 ℃、0.5% CO2培养箱中培养48 h后，将胰蛋白酶消化的细胞制备成细胞混悬液。将收获的4组细胞分别制成细胞滴片(1×107/mL细胞混悬液滴加至预先处理过的硝酸纤维素膜和载玻片上)、细胞裂解液，并提取DNA和蛋白质，进行免疫组化检测。

2.2 完整细胞蛋白质斑点印迹

采用间接酶标抗体免疫组化法：点膜标本经氯仿蒸气裂解细胞膜暴露细胞质内的蛋白质，加0.5%吐温-20/TBS(Tris- HCl pH 7.2)封闭，加各自的一抗，0.01%吐温-20/TBS洗2次，加碱性磷酸酶标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG，加DAB/NBT-BCIP底物液进行免疫组化显色，以PBS代替一抗作为阴性对照。

2.3 免疫细胞化学染色

4%多聚甲醛固定后的细胞标本入0.3%Triton X-100/PBS透化后，加10%正常羊血清，甩去多余血清，加1∶100稀释的各种一抗，置4 ℃湿盒内孵育过夜。PBS，pH 7.5洗后，加1∶200稀释的二抗(鼠IgG-HRP)，置37 ℃湿盒内孵育1.5 h，以DAB显色。阴性对照实验用PBS代替一抗。

2.4 检测指标

对细胞蛋白质斑点的印迹应用薄层层析扫描仪(Shimadu，日本)进行扫描并对免疫组织化学标本染色，应用图像分析仪(山富，中国)扫描各标本的免疫反应信号的灰度值。

3 统计学方法

采用SPSS11.5软件对以上数据进行统计学分析。所有数据用x±s表示，均值之间比较采用t检验。

4 结果

4.1 加味小柴胡汤对顺铂诱导BRL细胞核转录因子-kB、热休克蛋白70表达的影响

(见表1) 表1 各组细胞NF-kB、HSP70蛋白表达扫描灰度值(略)注：与空白组比较，**P＜0.01；与顺铂组比较，P＜0.05，P＜0.01

4.2 各组细胞免疫组化显色比较

细胞NF-kB经DAB染色呈棕黄色，正常组染色浅淡，顺铂组呈棕褐色，加味小柴胡汤大、小剂量组均明显较顺铂组浅淡，加味小柴胡汤大剂量组更为显著。提示顺铂处理组细胞NF-kB表达较正常组明显，应用加味小柴胡汤的实验组可下调NF-kB表达(见图1)。细胞HSP70染色呈棕色，正常组细胞染色较深，顺铂组较浅，加味小柴胡汤大、小剂量组染色均明显较顺铂组深。提示正常细胞HSP70表达明显，顺铂组HSP70表达降低，加味小柴胡汤大、小剂量组细胞HSP70表达明显上调(见图2)。

5 讨论

NF-kB是由B淋巴细胞核提取物中检测到的一种能与免疫球蛋白k轻链基因的增强子kB序列特异结合的蛋白因子，典型的NF-kB由p53和p65亚基组成。在静止状态下，NF-kB与I-kB抑制性蛋白结合处于未活化状态。当细胞受到炎性细胞因子、LPS等刺激时，I-kB激酶活化，I-kB从NF-kB复合体上解离，NF-kB发生核易位并与特定的DNA kB序列结合而促进基因转录。NF-kB可被炎性细胞因子激活，而后又诱导炎性细胞因子的表达。因此，早期应用抑制NF-kB活化药物，对控制炎症介质的大量释放将有所裨益[3]。由于活性氧(ROS)可激活NF-kB的表达[4]，在H2O2诱导的细胞凋亡中，可见NF-kB激活转录因子p53的表达[5]。本实验结果表明，顺铂诱导的BRL细胞NF-kB表达明显升高，提示顺铂致肝细胞损伤的发生机制与NF-kB的高表达有关。

HSP蛋白作为分子伴侣作用，是生物体或离体培养细胞在不良环境因素作用下所产生的一组具有高度保守性的应激蛋白，能保护细胞不受或少受损害。HSP70是目前发现的主要分子伴侣之一，能与蛋白分子结合，保护新合成的恰当构型。当蛋白质受损变性时，能促使其恢复或加速其降解和消除，以维护细胞的功能和生存。HSP70的增加可以提高细胞在各种应激状态下的生存能力，其细胞保护作用与应激时受损蛋白质的修复或移除有关，主要有抗氧化作用、协同免疫作用、抗细胞凋亡作用等几方面[6]。HSP70可增强机体对多种应激原的耐受能力，由于各种有害应激可激活细胞内应激激酶而导致细胞凋亡，而HSP70基因表达水平的增加，可抑制应激激酶的激活，防止细胞凋亡，这无疑对预防肝细胞损伤有积极意义。

本研究提示，加味小柴胡汤可下调顺铂诱导的BRL细胞NF-kB表达，上调HSP70表达，此作用可能是该方减轻细胞氧化损伤、抑制细胞凋亡的重要机理之一。

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热休克蛋白篇8

【摘要】 目的 ：研究拘束冷应激对大鼠肾脏组织热休克蛋白(heat shock protein 70，HSP70)表达和血清中皮质醇(Cortisol，CORT)含量的动态影响及可能的机制。方法：选取50日龄清洁级大鼠77只，随机分为7组，即0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h。采用拘束冷应激法，应激相应时间后，用免疫组织化学方法观察大鼠肾脏组织HSP70的表达，并检测血清中CORT含量。结果：血清中的CORT浓度在1.5 h呈现最高值，其余各时点变化不明显。光镜下可见HSP70在肾小球毛细血管内皮细胞的胞核及肾小管上皮细胞的胞核和胞浆中均有表达。肾脏中HSP70的表达首先呈增加的趋势，1.5～2.5 h HSP70持续高表达(P

【关键词】 拘束冷应激;大鼠;肾脏;热休克蛋白;皮质醇

Abstract: Objective: To study the dynamic effects of cold restraint stress on HSP70 expression　in kidney and serum corticosteroid content in rats， and explore its possible mechanism.　Methods: Seventy-seven 50-day-old SD rats were randomly pided into 7 groups，namely 0 h，0.5h，1.0 h，1.5 h，2.0 h，2.5 h and 3.0 h group. At corresponding restraint stress time，the expressionof HSP70 in kidney tissues were tested by means of immunohistochemistry and the level of CORTin serum was also examined. Results: The level of CORT reached its peak in 1.5 h group， but therewas no significant difference in other groups. Under the light microscope， the expressions ofHSP70 in the nuclei of renal glomerular capillary endothelial cells，in the nuclei and cytoplasmof renal tubular epithelial cells could be observed. The HSP70 expression in kidney increasedcontinuously first，then it was kept in a high level at stress time of 1.5 h， 2.0 h and 2.5 h(P

cold restraint stress may decreased or block the expressions of HSP70 in kidney.

Key words: cold restraint stress;rats;kidney;heat shock protein 70;Cortisol

当动物在各种极端环境因素如雪灾、地震等造成的寒冷束缚的刺激下，机体的组织、器

官、细胞内会产生各种类型的应激变化，这些变化能够反映动物的生理状态和健康状态。近

年来的研究发现，在热暴露、冷暴露和损伤等应激条件下，一组应激蛋白热休克蛋白家族

(heat shock proteins，HSPs)的表达水平会显著增加，HSPs在机体内作为一种分子伴侣而对机体起到保护作用[1-2]。以往相关的实验多基于慢性冷应激，关于急性冷应激对大鼠肾脏组织热休克蛋白(heat shock protein 70，HSP70)表达的动态影响的文献并不多见。本研究拟用饥饿后急性的拘束冷应激法对大鼠进行不同强度的应激，用免疫组化法观察大鼠肾脏组织HSP70的表达，并检测血清中皮质醇(Cortisol，CORT)含量，以期探讨饥饿后拘束冷应激对机体的影响及可能的机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

50日龄清洁级雄性SD大鼠77只，由温州医学院实验动物中心提供[SCXK(浙)2005-0019]，质量180～230 g。随机分为7组，即分别应激0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h，每组11只。

1.2 拘束冷应激模型制作及标本制作

大鼠禁食不禁水24 h后，将大鼠四肢束缚于网格板上，限制其活动，置于(5±1)℃冰箱内急性冷应激相应时间后取出，用乙醚深度麻醉，开腹、腹主动脉取血、分离血清备用;并快速取3只大鼠肾脏组织2块，每块体积约0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm，置于10%中性福尔马林中固定24 h以上，水洗、常规脱水、石蜡包埋，连续切片5μm备用。

1.3 血清CORT含量的检测

采用免疫放射分析(RIA)法测定大鼠血清CORT含量，由温州医学院迪安医学检验中心检测。

1.4 肾组织HSP70的表达

ABC免疫组化试剂盒购自北京中山生物技术公司。石蜡切片脱蜡水化，新鲜配制的3% H2O2，室温下孵育10 min去除内源性过氧化物酶，0.01 nmol/L 枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)热修复抗原，正常山羊血清封闭20 min;滴加兔多克隆抗体HSP70，稀释度1:100，4 ℃冰箱过夜;滴加山羊抗兔IgG，37 ℃烤箱孵育30 min，加SABC复合物，37 ℃30 min，DAB光镜下显色。实验以0 h组作为阴性对照。结果判定以细胞浆或细胞核染成黄色或棕褐色为阳性判定标准。每张切片随机选取10个观察区，采用Image-Pro Plus 5.1图像处理与分析系统分析免疫组化染色图像，根据HSP70阳性反应区域的面积(Area)和累积光密度值(IOD)计算每一张图片HSP70阳性表达量。

1.5 统计学处理方法

组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 血清中CORT含量的变化

前0～1.0 h大鼠血清CORT无明显变化，1.5 h时达到最高值，之后下降但无持续变化现象。1.5 h组与其他各组之间差异都有显著性(P 0.05)。见表1。

2.2 肾脏组织中HSP70表达的光镜观察

见图1。 HSP70在肾小球毛细血管内皮细胞的胞核及肾小管上皮细胞的胞核和胞浆中均有表达。0 h组大鼠肾脏HSP70也有表达。随着冷应激时间的增加HSP70表达量有所增强：0.5 h组HSP70表达量增强不明显;1.0 h组HSP70的表达量缓慢增强;1.5 h组及2.0 h组HSP70表达量明显增强，几乎每个细胞核都有表达;2.5 h组HSP70表达量有所减弱，肾小管上皮细胞内表达范围有所缩小;3.0 h组HSP70表达量明显减弱，肾小管上皮细胞内呈局灶性表达。

2.3 肾脏组织中HSP70表达的变化

见表2。各实验组肾组织中HSP70表达极显著地高于0 h组(P 0.05)，1.5、2.0、2.5和3.0 h组的HSP70表达较0.5、0.1 h组明显升高(P 0.05)，但显著高于3.0 h组(P

3 讨论

CORT是下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPA)的终末产物，是由肾上腺皮质分泌的一种糖

皮质激素，主要调节体内糖和蛋白质的代谢。人们发现各种应激原均可以导致外周血或者是

组织CORT升高[3]。本研究显示，血清中的CORT浓度在1.5 h呈现最高值，其余各时点变化不明显。此结果与早期相关研究相似[4-5]。HSP70几乎在所有生物的应激细胞中都经常高度地被诱导表达，HSP70赋予细胞或生物体从应激状态中恢复的能力，并保护它们免受应激的损害，是对环境和代谢应激综合反应的代表[6]。饥饿是一种强烈的应激原，拘束冷应激实验动物模型的制作过程中大鼠需经24 h饥饿处理[7]，导致0 h组也出现HSP70表达。本实验结果发现，肾脏中HSP70的表达首先呈增加的趋势，1.5～2.5 h HSP70持续高表达，之后下降，提示拘束冷应激诱导HSP70的大量表达从而对处于应激状态下的细胞起到一定的保护作用;光镜下也可以发现几乎每个细胞核都有表达。本实验还观察到，随着应激时间达到3 h时，肾脏组织中大鼠HSP70表达呈显著下降，此结果与以往研究并不一致[8]。在实验过程中，我们注意到拘束冷应激3 h后大鼠都出现体温下降、虚脱甚至濒死状态，提示此时组织中HSP70表达量显著降低并不是大鼠的“冷适应”，而是机体的衰竭现象，其可能的机制是当严重的伤害性应激阻断了HSP70的转录和(或)翻译过程，HSP70无法合成，不能发挥保护细胞的作用，从而导致机体出现严重损伤甚至死亡。

CORT与HSP70之间的关系复杂，尚无定论。Blake等[9]的研究证实，HSP70表达与HPA轴之间存在功能性联系，束缚应激后3～6 h，大鼠肾上腺皮质及胸主动脉可见HSP70表达;切除大鼠垂体后，束缚应激后未见HSP70表达;但给予ACTH后，又可以诱导HSP70表达。而Vijayan等[10]研究表明，皮质醇水平增高，对肝脏HSP70 表达没有影响。本实验结果显示，大鼠血清中CORT的含量在应激初期就升高，之后变化不明显，而肾脏HSP70表达量则在应激中后期达到最高，二者间是否存在必然的联系有待进一步的研究。

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