热休克蛋白在PC12细胞热应激创伤中的作用

时间:2022-07-13 07:21:58

热休克蛋白在PC12细胞热应激创伤中的作用

【摘要】目的 探讨热应激创伤对PC12细胞热休克蛋白70(HSP70)的影响。方法 用免疫细胞化学方法检测热应激对PC12细胞HSP70表达水平的变化。结果 在热损伤过程中HSP70和细胞增殖能力均显著高于对照组。结论 HSP70高水平表达作为是神经细胞自我保护的机制之一。

【关键词】热休克蛋白70创伤热应激PC12细胞

【中图分类号】Q753 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484(2010)03-00-02

Effects of heat shock protein 70 in traumic stress of PC 12 cells

【Abstract】Objective: To investigate the changes of heat shock protein 70 (HSP70) expression levels in neurons in traumic stress. Methods: The expression amounts of HSP70 were determined of PC12 cells using immunocytochemical approach during heat stress. Results: The expression levels of HSP70 increased in heat stress. In the present study, the proliferations of PC 12 cells also increased. Conclusions: High level expressions of HSP70 is one of protective mechanisms in PC 12 cells.

【Key words】Heat shock protein 70;Trauma;Heat stress;PC 12 cells

热休克蛋白 (heat shock proteins,HSP) 70 是一类广泛存在于所有原核和真核细胞内,具有高度保守性的蛋白家族,在正常情况下基础水平表达较低。当生物体受到应激刺激(如热、机械力、缺血、缺氧以及感染等)和其它损伤因素作用而发生应激反应时,就会启动HSPs台成基因,促使HSPs的合成,以对细胞起一定的保护作用[1,2]。本实验探究PC12细胞在热应激状态下表达HSP70的情况。

1 材料与方法

1.1 实验材料

PC12细胞为本实验室保存细胞株。HSP70单克隆抗体购自Sigma公司;SABC免疫细胞化学试剂盒由博士德公司提供,台盼兰染液等其它试剂为国产分析纯。

1.2 细胞培养

细胞培养体系为含l0%胎牛血清和双抗的MEM培养基,置于37℃,浓度为5%CO2的培养箱中。上述细胞培养试剂均购自GIBCO公司。

1.3 细胞存活率测定

实验分为热应激组和对照组。PC12细胞依3×104/孔密度接种于96孔板内,待细胞融台成单层后,予以热应激损伤刺激,即置于42℃水浴中20min,然后用培养液清洗三次,以除去脱落细胞;接着更换新鲜培养液在37℃恢复培养3h,用胰酶将细胞消化,台酚兰染色,计算细胞活性。

1.4 免疫细胞化学染色检测HSP70

将PC12细胞按照1×106/孔密度接种于24孔板内的直径为12mm的盖玻片上。PC12细胞融合后,予以热损伤刺激(同前述方法),应用免疫细胞化学方法分析HSP70表达变化。

1.5 统计学方法

热应激损伤组和对照组数据使用SPSS 10.0软件进行方差分析和t检验。

2 结果

PC12细胞为贴壁细胞,呈梭形或多突起形扁平状。一般地,接种24h后即可贴壁;培养48-72h即可达到增殖旺盛状态,形成单层融合。

细胞生存率评价结果显示,热损伤组和对照组PC12细胞生存率分别为90.9±2.7%和93.2±2.4%,实验组细胞存活率略低于对照组,但是,统计学分析两组比较无显著性差异(P>0.05)。

在实验组,热应激刺激后即可见PC12细胞浆内!HSP70表达,其表达一直持续在较高水平,即使当细胞长成单层时,HSP70的表达仍为阳性。与之相比较,对照组PC12细胞接种24h后细胞贴壁、伸展,HSP70表达基本为阴性;48h时细胞增殖旺盛,可见细胞分裂现象,胞浆及胞核内均可见HSP70着色;72h后长成单层细胞,HSP70表达又转为阴性。

3 讨论

作为一种非特异性细胞保护蛋白质,Hsp70主要通过提高细胞对应激原的耐受性、分子伴侣作用以及抗细胞凋亡等途径达到对细胞的保护[3]。近年来,大量研究证实HSP70在哺乳类动物损伤局部迅速诱导产生,对机体有明显的保护作用[4]。采用免疫组化染色可以直接观察细胞和/或组织中HSP70的表达。

生物体在各种损伤后将启动复杂的全身反应,导致机体内一系列特殊应激因子的基因表达,HSP70就是在各种刺激因素作用下细胞内诱导合成的蛋白质。研究报道HSP70在组织细胞损伤的过程中表达增强,并对细胞具有保护作用,同时也能反映细胞损伤的程度[5,6]。细胞内HSP70的表达是当今的研究热点,研究认为细胞外的HSP70在机体的生理和免疫机制上起着主要的作用,其中包括保持自身遗传的高度保守性、免疫应答的调节等。但其作用机制还需进一步的研究。有文献报道,应激时大部分诱导型Hsp70位于细胞核内并包围核仁,恢复后则移人胞浆,另外血液中的单核细胞、神经胶质细胞、动脉血管内皮细胞等能够释放HSP70[7]。

本研究以PC12神经细胞为实验对象,研究热应激损伤对HSP70的影响和作用。实验结果表明在热应激损伤作用下,神经细胞中HSP70作为细胞自我保护机制,HSP70蛋白持续较高水平表达,可能与早期免疫炎性反应及创伤愈合有关。数据显示HSP70的表达变化与细胞和/或组织的增殖活性密切相关。即细胞增殖旺盛时,HSP70表达水平升高。换言之,在创伤的早期,HSP70的表达以炎细胞为主,当细胞/组织转入修复阶段时,HSP70开始在修复的细胞/组织中表达,在细胞/组织增生旺盛时,表达更为强烈;当创伤完全愈合后,HSP70的表达水平逐渐下降。其作用机制有待于在将来工作中从分子水平上深入研究,加以阐述。

4 结论

热休克蛋白是细胞受应激原刺激后诱导产生的一组应激蛋白,一般认为HSP70可以提高细胞的应激能力,抵御各种损害因素的影响,起到保护细胞的作用。研究表明,HSP70在创伤后即开始在神经细胞中持续较高水平表达。

参考文献

[1]Ohkawara T. Takeda H. Nishiwaki M et a1. Protective effects of heat shock protein 70 induced by geranylgerany―lacetone on oxidative injury in rat intestinal epithelial cells. Scand J Gastroenterol,2006,41(3):312.

[2]Harder Y. Contaldo C. Klenk J 'et al. lmproved skin flap survival after local heat preconditioning in pigs.J Surg Res2004,119(1):100.

[3]王昭领 热休克蛋白70与创伤愈合关系的研究进展 中国新医药 2004,3(7) 81

[4]周继红 热休克蛋白与中枢神经系统损伤,创伤外科杂志,2002,4(2)118

[1]任碧琼, 贺军宇, 刘丰伟,等 颅脑损伤患者血清热休克蛋白70水平的变化 检验医学 2008,23(6)664

[5]Salehi AH,Morris SJ,Ho WC,et a1.AEG3482 is an antiapoptotic compound that inhibits Jun kinase activity and cell death through induced expression of heat shock protein 70.Chem Biol,2006,13(2):213

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作者单位:同济大学附属第十人民医院 急诊科200072

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