玉米花粉多糖的提取工艺优化

摘要：玉米花粉多糖是从玉米花粉中提取出来的一种具有较高生物活性的水溶性多糖。通过对玉米花粉多糖提取温度、时间、料液比及提取液的pH值等因素的实验结果分析，发现影响最显著的因素是pH值，其次是提取时间的影响，温度，料液比的影响最为微弱。从而得出的最佳提取条件组合是：pH值10，时间3h，温度60℃，料液比1∶5。且最佳提取次数为2次。

关键词：玉米花粉多糖提取工艺优化

玉米花粉多糖(pollen polysaccharides of maize，PPM)系从玉米花粉中提取的水溶性多糖，已有研究表明，PPM可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数；可显著提高小鼠的免疫功能；PPM对大鼠肺泡巨噬细胞也具有激活作用；而且PPM可以抑制肿瘤，对高血脂也有一定的疗效[1-6]。而关于玉米花粉多糖分离纯化的研究较少。本文主要研究了玉米花粉多糖的提取工艺研究，为玉米花粉多糖的进一步开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

玉米花粉由武汉小蜜蜂食品有限公司提供。

1.2 试剂及仪器

试剂：硫酸、三氯甲烷、苯酚、石油醚、盐酸、氢氧化钠、葡萄糖、酒石酸钾钠、乙酸铅、硫酸铜、乙醇、正丁醇、氯仿、氯化钠，均为国产分析纯。

仪器：电热恒温水浴锅，北京医用设备总厂；

HITACHI紫外－可见分光光度计，HITACHI；

离心机，北京医用离心机厂；

原子吸收分光光度计，SM11-WFX-1C；

高速万能粉碎机粉碎机FW－100，上海申光仪器仪表有限公司；

PHs-3C型pH计，上海雷磁仪器厂；

分析天平，MonoBloc。

1.3 试验方法

1.3.1 玉米花粉样品的预处理

玉米花粉团去杂粉碎石油醚（1∶3）60℃水浴抽提10h取出晾干

1.3.2 玉米花粉化学成分检验

采用常压干燥法测定玉米花粉水分含量，索氏抽提法测定脂肪含量，凯氏定氮法测定蛋白质含量，费林试剂法测定还原糖及总糖含量[7]；多糖含量的测定[8]采用苯酚―硫酸法；微量金属元素采用原子吸收法测定。

1.3.3 玉米花粉粗多糖提取的正交试验设计

通过对提取温度、时间、料液比及pH值四个因素进行单因素实验，选取最佳提取条件进行正交试验，并研究了提取次数对多糖提取率的影响。

2 结果与分析

2.1 玉米花粉化学成分检验结果

玉米花粉化学成分检验的结果，如表1。

2.2 玉米花粉多糖标准曲线的绘制

精确称取已干燥的葡萄糖20μg，分别溶于100ml重蒸水中，分别吸取15ml、30ml、45ml、60ml、75ml、95ml，在分别稀释成浓度为30μg/ml、60μg/ml、90μg/ml、120μg/ml、150μg/ml、190μg/ml取0.2ml样液于试管中，加水至10ml，再向试管中加入50g/L苯酚0.4ml混合后，迅速加入2ml浓硫酸，混合均匀后，室温放置30min，在波长490nm下测定吸光度，绘制曲线图，如图1。通过excel作图得到方程为：y＝0.0058x－0.0341，方程的相关系数达到0.999。

2.3 玉米花粉中微量元素

玉米花粉中微量元素的含量如表2。从表中可以看出，玉米花粉富含钙、镁、铁、锌、镉等多种人体生长发育所必需的微量金属元素，其中Ca的含量高达9.65mg/kg，含量最高。同时，我们在检测中也发现铅的含量偏高，这可能是由于在处理原料玉米花粉时，使用报纸晾晒的原因。

2.4 单因素实验

2.4.1 温度的影响

分别取10g花粉样品，按料水比1∶10加入100ml蒸馏水，然后分别在60℃、70℃、80℃、100℃，pH7下水浴，每间隔1小时取样液，并做平行，到5小时停止水浴，冷却，用砂芯漏斗抽滤，取滤液。采用改良苯酚－硫酸法比色，从中可以得出温度和提取时间对提取的影响，见图2。

从图中明显看出，70℃下水提，多糖得率显著高于其他温度，其次是60℃和80℃，100℃条件下得率最低。且从图中可以看出提取2h以内，60℃提取的多糖浓度低于80℃，提取时间延长后，前者提取率显著提高。100℃提取时，随着时间增加多糖浓度先缓慢升高，超过3h后反而有下降的趋势。可能是因为，高温下长时间提取会造成多糖分解；且玉米花粉中蛋白含量较高，多糖可能与蛋白以糖蛋白的形式结合，导致在高温下蛋白变性，影响多糖的提取，所以在70℃时最利于多糖的溶出。

2.4.2 提取时间的影响

从图2也可看出随着时间的延长，玉米花粉多糖的浓度逐渐升高，过了3h后多糖浓度上升的趋势趋于平缓。因此，认为3h为多糖提取的最佳时间。

2.4.3 料液比的影响

为探讨提取玉米花粉多糖的最佳加水比例，将花粉样品按不同料液比在60℃，pH7水浴抽提3h，测定提取液多糖浓度进行比较，结果见图3。

由图3可见，当料液比为1∶5、1∶10、1∶15和1∶20时多糖的得率分别为4.65％、5.92％、5.37％和4.22％。不同料液比提取出的多糖得率相差很小，料液比对多糖提取的影响并不显著。料液比为1∶10时，提取多糖得率最高，1∶20时多糖得率较低。

2.4.4 不同pH值对提取的影响结果

因为不同pH值对提取玉米花粉多糖的作用不同，所以用不同pH值的水液进行提取具有不同的结果。采用盐酸、氢氧化钠配成pH分别为4、8、10、14的提取液，在温度60℃，料液比1∶10下水浴抽提3h，以确立pH条件，结果见表3。

由提取结果可看出，用pH4提取液提取比水提取高出51.26％，这是因为酸对玉米花粉的细胞有一定的水解作用，会使细胞壁因水解而变得疏松有利于糖分的浸出。当多糖与蛋白结合时，酸也可能水解蛋白糖的结合键，使糖游离出来。同时由于酸对多糖的水解作用，可能破坏糖的生物活性，故多不采用酸提法。用pH8、pH10提取时，多糖得率均比水提取高，这可能是因为玉米花粉中多为中酸性多糖，碱有利于酸性多糖的浸出。另外，碱对细胞同样具有破坏作用，会使细胞壁降解，有利于多糖的浸出。但是，从表中，我们也发现，当碱的浓度超过一定值后，其提取率反而下降。故应该注意碱浓度不能太高，以免使多糖变性从而失去生物活性。从上表中还发现不同提取液的颜色不同，说明不同pH值对色素的溶出贡献不同，也可能伴有发色反应。过深的颜色对后期的脱色将造成困难。另外，pH14时花粉多糖变性致使滤渣成粘稠状，且伴有恶臭味，不利于对花粉滤渣的后期综合利用。

2.5 正交实验结果及分析

在单因素实验结果基础上确定正交实验的因素水平，确定四因素三水平，即因素a温度，水平60℃、70℃、80℃；因素b时间，水平1h、2h、3h；因素c料液比，水平1∶5、1∶10、1∶15；因素dpH值，水平8、10、14。正交实验因素水平表见表4。

正交实验用总糖含量为标准判断提取效果，得实验结果见表5。

对表5的实验结果进行方差分析，分析结果如表6：

从表6可以看出，各因素组间重复性具极显著性，所以实验数据是可信的。且从方差分析中看出，各试验因素对玉米花粉多糖的提取率都有贡献。

对表5的数据进行级差分析见表7，结果为Rd>Rb>Ra>Rc，由此可以看出对玉米花粉多糖提取影响最为强烈的因素是pH值，其次是提取时间，温度、料液比紧随其后。再从表中K值分析，Ka1>Ka2>Ka3，Kb3>Kb2>Kb1， Kc3>Kc1>Kc2， Kd2>Kd1>Kd3从中可以看出温度因素中60℃，时间因素中最优为3小时，料液比最好为1∶5，pH值最好为10。综合以上分析可以得出水提玉米花粉多糖的最佳条件是pH值10，时间3h，温度60℃，料液比1∶5。

2.6 提取次数的影响

为探讨提取玉米花粉多糖的最佳提取次数，在60℃水浴抽提，料液比1∶5，pH10，每次3h的条件下，进行三次抽提实验，比较提取液多糖浓度，结果见图4。

如图所示，第一次的提取率较大，而第二次、第三次提取出的多糖浓度很低，从中可见多次重复提取没有必要，只需提取两次就可以将花粉中多糖的99.56％提出。而且从生产成本来看，采取两次提取多糖是最佳的。

3 小结

3.1 通过分析正交实验结果，可以得出在影响玉米花粉提取的诸因素中最显著的影响因素是pH值，其次是提取时间的影响，再者就是温度的影响，料液比的影响最为微弱。从而得出的最佳提取条件组合是：pH值10，时间3h，温度60℃，料液比1∶5。

3.2 考虑到经济效益和成本因素，玉米花粉多糖经两次提取就可以达到99％，故最佳提取次数为两次。