体外诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的研究进展

项正兵　吴晓牧

中图分类号：R392.4　文献标识码：A　文章编号：1672-1349(2007)07-0604-02

随着人类胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)的使用，提出了许多伦理学上和病人特异性胚胎干细胞获得的困难性上的问题，选择成体干细胞作为细胞移植替代治疗变得非常现实。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)作为一种自体干细胞，具有很强的自我更新、增殖能力以及多向分化的潜能。BMSC在体外不同的诱导条件下可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱、肌肉细胞、神经细胞等多种细胞。由于BMSC有取材方便、易于体外培养扩增、植入体内不易引起免疫排异反应、不存在伦理学争议等众多优点，且最近的研究表明BMSC在体内、外都能被诱导成神经元样细胞，且植入体内能改善神经功能缺损症状。因此，BMSC的研究越来越受到人们的关注。本文结合最新进展就体外诱导BMSC向神经元样细胞分化的方法及其可能的机制进行综述。

1　以抗氧化剂为基础的诱导方案

BMSC向神经元样细胞的分化，首先由Woodbury等报道，他们用抗氧化剂β-巯基乙醇(β-mercaptoethanoi，BME)或二甲基亚砜(dimethytsulfoxide，DMSO)／丁羟茴香醚(butylated hydroxyanisole，BHA)等体外诱导成年大鼠和人BMSC分化。发现BMSC呈现为神经元形态，同时表达神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)、神经元核抗原(neuronal nuclear antigen，NeuN)和神经微丝M(neumfilament－M，NFM)等神经细胞标志物。5h后，被诱导的细胞表达神经干细胞标志物神经巢蛋白(Nestin)；6d后，Nestin表达消失，而TrkA(一种神经生长因子受体)则在5h至6d持续表达。这提示BMSC经诱导后先分化为神经干细胞而后逐渐向成熟的神经细胞转化。此后，这一诱导方法被广泛用于BMSC向神经元体外分化的研究。抗氧化剂诱导作用机制尚不清楚，研究证实，活性氧在细胞增殖分化过程中起到第二信使的作用，抗氧化剂是否通过改变BMSC内的氧化还原状态使其分化为神经细胞有待进一步研究。近年来在探讨抗氧化剂诱导BMSC体外分化机制时，有的研究发现，用DMSO和BHA等化学诱导剂使BMSC在1h内诱导分化为神经元样细胞，其实是由于细胞骨架结构肌动蛋白断裂、细胞收缩而产生的一种现象。Lu等也证明，在BME或DMSO／BHA诱导BMSC分化过程中，在不同时间点对镜下相同视野观察，形成的所谓神经元样细胞的突起是细胞延长部分收缩而成。化学诱导剂诱导神经元样细胞形成可能是化学物质产生的毒性使细胞收缩或细胞骨架变化的结果，并不能代表复杂的细胞分化进程。

2　以提高胞内cAMP为基础的诱导方案

Deng等联合应用异丁甲基黄嘌呤(isobutylmethylxanthine，IBMX)和双丁酰环腺苷酸(dibutyryl cvclicAMP，dbcAMP)提高BMSC胞内cAMP的含量，6d后，发现约25％的BMSC在形态上转变为神经样细胞。最近Long等用NEUROBASAL培养液诱导BMSC向神经细胞分化，即在dbcAMP和IBMX以提高胞内cAMP基础上加入新的细胞因子如脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、人表皮生长因子(human epidermal growth factor，hEGF)和碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，hFGF)。诱导6d，66％的细胞具有典型的神经细胞树突形态，免疫组化和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)证实部分细胞表达早期的神经标记物(如Nestin和β微管蛋白Ⅲ)，也有细胞表达成熟神经细胞的标记物，如神经丝蛋白(neurofilament，NF)，NeuN，Tau，胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)。关于提高胞内camP浓度能促使BMSC向神经细胞的分化的机制，有人认为可能与cAMP能激活PICA或p38，ERK1/2等信号途径有关。最近Jori等认为除了胞内cAMP浓度的增加会激活经典的PKA途径从而影响BMSC向神经细胞的分化外，MEK-ERK信号等也和BMSC向神经细胞诱导分化有关。此外，cAMP还可引起POU家族转录因子Brn-3a表达的增加。Brn-3a在神经元的早期分化中起关键作用，它调控了NF，α-intexnextin等多种神经轴突骨架蛋白的表达。

3　以细胞生长因子为基础的诱导方案

细胞的增殖和分化受各种生长因子的影响，在这些因素中，神经营养因子的作用尤为关键。Smmhez-iarrlos等建立了主要以神经营养因子V为基础的诱导BMSC分化为神经细胞的培养体系，诱导7d～14d后，发现有BMSC分化为神经细胞。近年研究显示，EGF，bFGF，BDNF和胶质细胞源性神经营养因子(glial-derived neumtrophic factor，GDNF)等因子在BMSC向神经细胞分化中起着重要的作用，已有科学家利用DNA测序方法检出这些细胞因子的受体存在于BMSC的细胞膜上，因而有人推测这些因子与其相应受体结合后，可将有关信号转导致细胞质或细胞核内，从而发挥对细胞的调控作用，但确切机制尚不清楚。bFGF是体内重要的神经营养因子，可促使神经干细胞增殖并决定其分化方向，并具有加快胶原降解，恢复凋亡细胞活力等重要功能。它可能参与BMSC向神经元分化的启动，是一种有效的有丝分裂原和分化抑制因子，可影响中胚层、神经外胚层的细胞增殖和分化。Kim等发现，FGF和维甲酸(retmoic acid，RA)诱导人BMSC后，16％的细胞表达NF。BDNF在神经细胞发育、存活及损伤修复中起关键作用，对BMSC在体外向神经细胞分化具有明显的促进作用。

4　以维甲酸(RA)为基础的诱导方案

RA是一种重要的形态发生素，在胚胎期对胚胎干细胞(ESC)向神经细胞分化起重要作用。有研究表明RA能诱导ESC向神经细胞分化，随着浓度的不同而变化，低浓度RA诱导ESG分化为神经前体细胞，高浓度RA促进神经前体细胞分化为成熟的神经元和胶质细胞。离体的研究表明RA在神经系统各部位的发育也起重要的作用。RA促进神经系统背腹侧、首尾端的形成。此作用也因RA浓度不同而变化。低浓度RA诱导拟胚体细胞主要向腹侧表型分化，而高浓度RA诱导拟胚体细胞背侧化。RT-PCR显示低浓度RA处理组的拟胚体细胞

中后脑特异性标志物(otxl，otx2，en1，hoxb1，hoxa2)阳性，而脊髓神经标志物阴性。浓度RA处理组后脑和头端脊髓标志物(hoxc4，hoxc5，hoxc6)表达增加，前脑和中脑标志物表达降低。高浓度RA诱导ESC分化为后脑和脊髓躯体运动神经元；而低浓度RA诱导ESC分化为后脑内脏运动神经元或支配上肢的躯体运动神经元。低浓度RA可诱导腹侧化，在此过程中音猬因于(sonic hedgehog，ShE)表达水平升高有关。Wichterie等用RA和Shh或Shh激动剂Hh-ag1.3联合处理拟胚体可诱导ESC分化为运动神经元，该作用随Hh Ag 1 3浓度增加而增加，而RA联用Hh抗体，则检测不到运动神经元的分化。可见RA和Shh均是在神经发育过程中的重要因子，在MN的形成中有不可或缺的作用。目前已有使用RA与抗氧化剂或细胞因子联合成功诱导BMSC向神经元细胞分化的报道。但是有关使用RA和Shh成功分化为MN的研究对象都是ESC，尚未见BMSC向MN分化的报道，因此，成功诱导BMSC分化为功能性神经元将具有重要意义。2005年，Kondo等D0]的研究表明BMSC内能表达RA受体(RAR)及Shh信号传导途径的一些分子。BMSC预先经FGF2和福斯高林(一种血小板凝集抑制剂)处理后，再经RA和Shh联合诱导后的BMSC能表达谷氨酸能感觉神经元的标志物，BMSC的可塑性进一步被证实。认为其机制可能是RA与细胞核内的RAR结合进而调控一系列基因表达，使细胞表型和分化发生改变。另外将BMSC置于胚胎10d的脑／体节／听泡条件培养液时，发现BMSC中感觉神经元的标志物上调和促进突起生长。提示在适当的体内模拟环境下BMSC可向特点的神经元分化。有可能将来代替ESC，以避免使用ESC引起伦理学争议。

5　BMSC在体外与神经细胞共培养方案

BMSC除了在上述诱导剂、细胞因子等的刺激作用下能向神经细胞分化外，BMSC与神经细胞混合培养时也能使BMSC分化为神经元细胞，且分化率升高。如将BMSC与新生胎鼠脑组胞共同培养时，其向神经元分化的能力远大于BMSC单独培养的结果，NSE和NF的表达显著增高，这说明细胞与细胞之间的相互接触也是BMSC分化的一个重要原因。有研究将星形胶质细胞与BMSC共培养时，发现星形胶质细胞能够明显促进BMSC向神经元方向分化，这是因为星形胶质细胞不仅对神经元有支持营养作用，它还能释放一系列神经营养因子、生长因子等，从而主动参与神经元信息处理过程，调控神经干细胞的分化，刺激神经元的产生。说明脑内局部微环境在BMSC移植入体内分化成神经元的过程起着重要的作用。

尽管BMSC向神经细胞分化的研究已获得了一些令人鼓舞的结果，但仍有一些问题亟待解决。①BMSC的分离、纯化，实验证明体外的BMSC均为多种细胞的混杂，如何才能有效地获得纯的BMSC，有待对BMSC的细胞学特点和分化各阶段细胞标志物的进一步研究；②体外BMSC向神经细胞诱导分化模式和分子调控机制还不甚清楚，尤其是最近有学者对长期公认的DMSO等抗氧化剂诱导结果提出了置疑，需要进一步探讨可行、可靠的诱导方法，且对诱导分化的神经细胞的鉴定不应仅限于形态学和细胞标记物，还应证实存在其他神经元功能的标志，如突触的结构和功能、动作电位和突触释放神经递质等；③细胞移植替代治疗的安全性如何?如何既能控制增殖，避免形成肿瘤，又能在适当的时候启动所需的分化路径，还有待进一步研究。而这些问题的解决以及人们对BMSC的研究进一步深入，必将使BMSC在细胞移植替代治疗中的应用走上一个新的台阶。