推拿(扌衮)法对骨骼肌细胞内钙离子浓度\细胞凋亡率的影响

摘要 目的：推拿(扌衮)法对骨骼肌细胞内钙离子浓度、细胞凋亡率的影响。方法：采用细胞培养技术，培养大鼠四肢骨骼肌细胞，建立骨骼肌细胞损伤模型，将正常细胞和损伤细胞分别分为对照组、推拿组、推拿+维拉帕米组及损伤细胞学员推拿组，分别对各组细胞内Ca2+浓度和细胞凋亡程度进行检测。结果：损伤细胞内游离Ca2+浓度显著增高，细胞凋亡程度明显改善，但加入钙离子拮抗剂维拉帕米后，各项指标的改变均受到显著的抑制。结论：推拿(扌衮)法对细胞内Ca2+浓度和细胞凋亡率有影响作用。

关键词　推拿　(扌衮)法　舒筋　骨骼肌细胞　Ca2+　凋亡

推拿法的功效已被无数临床实践所证实，但迄今为止推拿(扌衮)法影响细胞的机制尚不甚清楚。本研究采用细胞培养技术，建立骨骼肌细胞损伤模型，将骨骼肌细胞放入压力换能器液压耦合系统中，培养液中分别加入／不加Ca2+拮抗剂维拉帕米，给予最佳动力学参数(扌衮)法推拿，采用细胞生物学及分子生物学技术检测骨骼肌细胞胞浆Ca2+浓度、及细胞凋亡率，以期证明推拿(扌衮)法是通过恢复Ca2+稳态，改善细胞凋亡等途径，从而引发舒筋生物学效应，阐释推拿(扌衮)法从机械信号到电生理及化学信号的转导途径，探索手法刺激在体内的传导规律，为推拿疗法的作用机制提供理论依据和重要的实践资料。

1材料与方法

1，1主要仪器设备　流式细胞仪(美国BectonDickinson公司)、Ⅱ型推拿(扌衮)法测试仪(上海市中医药研究院推拿研究所研制)、超净工作台(中国苏州净化设备公司)、CO2孵箱(美国Thermo公司)、倒置显微镜(日本Nikno公司)、37℃恒温水浴箱(美国Thermo公司)、37℃恒温水浴锅(美国Thermo公司)、台式离心机(美国Thermo公司)。

1，2主要材料和试剂 细胞培养所需的试剂：大鼠骨骼肌细胞株(中国上海生命科学研究院细胞库，代号：L6)、DMEM完全培养基(每升青霉素100u，pH-7.4，美国Hyclone公司)、胰蛋白酶(Trypsin，1：250，美国Amresco公司)、盐酸维拉帕米注射液(中国上海禾丰制药有限公司)、二甲基亚砜(DMSO，美国Amresco公司)、Fluo 3-AM(DOJINDO日本株式会社同仁化学研究所)、Pluronic F-127(DOJINDO日本株式会社同仁化学研究所)、HEPES buffer saline(美国Sigma公司)、钙特异性络合剂(EGTA、美国Sigma公司)、凯基Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒凯基生物科技发展有限公司、0.25％胰蛋白酶(不含EDTA、上海医药工业研究院研制)。

1，3研究方法

1，3，1大鼠骨骼肌细胞培养及细胞损伤模型的建立：骨骼肌细胞传代培养：将骨骼肌细胞株放入37℃恒温CO2孵箱孵育，培养24小时后倒置显微镜下观察细胞无污染，细胞满度已达到80％，然后按照文献进行传代培养。骨骼肌细胞损伤模型参考文献方法建立。

1，3，2细胞分组及处理：细胞分为损伤细胞和正常细胞。损伤细胞进行损伤造模后，分为对照组、推拿组、推拿+维拉帕米(ver)组和学员推拿组；正常细胞培养时间同损伤造模组，分为对照组、推拿组、推拿+维拉帕米组(ver)。每个组含有12个样本。推拿时将骨骼肌细胞放人自制手法模拟细胞培养管内，同时用Ⅱ型推拿(扌衮)法测定仪同步采集手法参数，以控制(扌衮)法操作质量。

(1)对照组：细胞不做任何处理，但细胞标本制备程序、时间同其他各组；

(2)推拿组：由从事推拿操作10年以上的医师施加手法操作。当培养管内骨骼肌细胞满足实验条件时，关闭培养管两端阀门，放置在厚约4cm，与肌肉弹性系数相同的弹性材料中间，在Ⅱ型推拿(扌衮)法测定仪的测力平台上，施以舒筋效应最佳动力学参数的(扌衮)法推拿，(扌衮)法的动力学参数为力量4kg、操作时间10min、频率120次／分。

(3)推拿+Ver组：由从事推拿操作10年以上的医师施加手法操作。实施(扌衮)法操作前，先将稀释100倍的维拉帕米(Ver，5mg／2ml)加入培养管内，使管内Ver终浓度为10-5mol／L。然后实施(扌衮)法操作，方法同推拿组。

(4)损伤细胞学员推拿组处理：细胞先进行损伤处理，损伤处理方法同损伤组，推拿时由初学推拿的学生进行推拿操作，同时用Ⅱ型推拿(扌衮)法测定仪同步采集手法参数。

1，3，3Ca2+开究方法及指标测定：

(1)Fluo 3-AM荧光探针标记：各组细胞在损伤、推拿处理后用Fluo 3-AM标记，然后用流式细胞仪检测。

(2)骨骼肌细胞[Ca2+]i测定：取负载Fluo 3－AM的大鼠骨骼肌细胞悬液0.5ml，加入3ml聚乙烯试管中，用CellQuest软件获取和分析数据，激发波长为528nm，测定时，用侧向角(ssc)－F1(Fluo 3－AM)散点图识别骨骼肌细胞，见图1，用F1直方图测定平均荧光强度。每个样本获取一万个骨骼肌细胞。用Crykiewicz G的等比值法公式计算出骨骼肌细胞内[Ca2+]i=Kdx(F-Fmin)／(Fmax-F)。式中Kd是结合Fluo 3-AM的解离常数，为540nmol／L。F为各样本荧光强度测定值。Fmin和Fmax分别是最小荧光强度和最大荧光强度测定值，见图2、3。

1，3，4细胞凋亡率研究方法及指标测定：

(1)细胞经损伤、推拿处理后，2000rpm离心5min，加入DMEM培养液重悬细胞，放入室温保存待测。

(2)配制Annexin V-FITC细胞凋亡检测工作液后混匀，室温、避光、反应15min，然后立即应用流式细胞仪对样本进行检测。

1，4统计分析用SPSS13.0统计软件，选择One－Way ANOVA程序，进行各组均数间的比较，统计结果用-X-+SE表示。

2结果

2，1推拿(扌衮)法对骨骼肌细胞内[Ca2+]i的影响，见表1、图10。

结果显示，损伤细胞对照组与正常细胞对照组比较[Ca2+]i显著增高，也明显高于损伤细胞推拿组；而损伤细胞推拿+Ver组[ca2+]i显著高于损伤细胞推拿组，与损伤细胞对照组没有显著差异；学员推拿组和损伤细胞推拿组[ca2+]i均显著低于损伤细胞对照组。

2，2推拿(扌衮)法对骨骼肌细胞凋亡率的影响，见表2、图11。

结果显示，推拿对正常细胞的凋亡程度没有显著影响。损伤细胞对照组凋亡程度显著高于正常细胞对照组，且显著高于损伤细胞推拿组；损伤细胞推拿+Ver组凋亡程度显著高于损伤细胞推拿组，且较损伤细胞对照组无显著差异；学员推拿组凋亡程度明显低于损伤细胞对照组，但显著高于损伤细胞推拿组。

3分析与讨论

近年来国内外的研究证实，机械刺激能够激活细胞内的多条信号转导通路，这些通路与化学刺激引起的信号通路并无两样。目前已经证实，Ca2+通道已被认为是细胞膜上的一种机械刺激“受体”。它是启动机械刺激、激活信号转导通路的关键因素之一。 对于骨骼肌细胞来说，Ca2+对其收缩功能是必需的，但骨骼肌细胞内钙超载(Calcium overload)却是引起骨骼肌细胞发生各种病理状态的主要原因，在肌紧张病理机制中起主要作用。机械力刺激通过恢复钙离子稳态，帮助改善受损的细胞膜，改善了细胞内物质的代谢，这也是推拿(扌衮)法舒筋效应机制所在。

细胞凋亡是肌肉产生损伤和张力增高的重要原因，进一步可引起相关组织的损伤，导致疾病的发生。实验证实肌细胞Ca2+浓度、SOD／MDA比值变化是决定肌细胞凋亡或坏死的关键，细胞凋亡率的变化是检测肌肉损伤和疲劳深度的有效指标，可表明机能状态的好坏。

本实验结果发现，骨骼肌损伤后细胞凋亡率与钙离子浓度水平成比例升高，说明细胞内钙超载可以激活凋亡途径。推拿(扌衮)法能够有效的恢复钙离子稳态，这也就不难解释推拿能够改善细胞凋亡程度的机理。细胞处于低钙离子环境，可抑制或延迟细胞凋亡的发生。药理学方法研究证实，通过Ca2+载体或抑制内质网上Ca2+-ATP酶提高细胞内Ca2+浓度均可引起凋亡，而钙离子拮抗剂能够拮抗Ca2+诱导的细胞凋亡作用。本研究中在加入钙离子拮抗剂Ver后，推拿对损伤细胞凋亡率改善没有明显变化，推拿(扌衮)法舒筋效应明显被阻断，证实了钙离子信号转导作用确实与细胞凋亡有着密切的关系。

Ca2+是肌肉收缩的启动因子，肌细胞内Ca2+增加，使肌纤维收缩丧失控制，引起肌肉受缩相对增强，肌张力增高，运动能力下降。本实验结果显示，损伤细胞对照组凋亡程度显著高于正常细胞对照组(P

推拿(扌衮)法通过调节细胞内高钙水平，恢复细胞内钙离子稳态，减少细胞凋亡，改善细胞机能状态。