观察细胞形态的新工具-原子力显微镜

【摘要】 原始生命向细胞进化所获得的重要形态特征之一，是生命物质外面出现了一层膜性结构，即细胞膜。细胞膜位于细胞表面，厚度通常为7～8 nm，由脂类和蛋白质组成。对细胞表面形态的常规观察，主要用光镜和扫描电镜。这两种研究手段的不足是：光镜分辨率低，不能识别细胞的细微变化；扫描电镜的样品制备过程复杂，需对细胞进行特殊固定，可能失去细胞原本的生活形貌，且无法对细胞结构进行动态观察[1]。

【关键词】 原子力显微镜；细胞膜；超微结构

1 原子力显微镜的简介

1981年Binnig和Rohrer[2]等利用隧道效应研制出了第一台扫描隧道显微镜1986年Binnig[3]通过改进STM研制出第一台原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)。最初的AFM是在一个弹性悬臂上固定一个尖端极细的探针在样品表面扫描。探针针尖上的原子与样本表面的原子之间存在斥力，扫描时针尖随样本表面的高低起伏变化，使悬臂随之上下起伏，被安放在导电悬臂上方的隧道扫描探针转化成隧道电流变化而被纪录，经计算机处理后形成样品表面的三维形貌图。后来该方法被改成用一束激光照到悬臂上，其上下起伏可由激光束的变化所反映并被反射到接收装置中。根据针尖与样本的接触情况，AFM有两种扫描模式：接触模式与轻敲模式，前者指针尖在扫描过程中始终与样品接触，后者则是利用悬臂的高频震动使针尖间断地与样品接触[4,5]。AFM的成像原理决定了它的某些优点是其他显微技术所不具备的:观察的样品范围很广,AFM可在真空、空气、液相中观察样品；制样简单，样品不用包埋与切片，有无导电性均可，也不用特殊处理[6]；由于可在液态环境中观察，故AFM可在生理条件下对活细胞进行观察，并可实时观察某些动态的生化反应；分辨率极高，横向分辨率最高可达0．1 nm，纵向分辨率甚至可达0．01 nm，已超过电镜的分辨本领；成像时间短，可捕捉一些快速反应过程。除观察之外，AFM还可以对样品进行操作，如打磨、转孔、切割，这是一般的观察手段所不能完成的[1]。由于这些优点，使AFM的应用早已不局限在材料科学领域，而越来越多地被应用于生命科学研究的各个方面。

2 AFM的细胞形态研究现状

2．1 细胞水平成像的研究

最初的AFM由于扫描范围太小(不到1 μm)而不能用于细胞成像，到1989年经改进的AFM的扫描范围达到几个毫米后才广泛用于白细胞、红细胞、植物细胞和细菌细胞等的成像。随后人们对细胞膜的结构包括膜孔、表面抗原、膜蛋白、膜的力学特性(膜的硬度、黏弹性)和细胞的行为(相互作用、生长、伪足形成)进行了深入研究。红细胞是研究较多的细胞之一。在室温条件下对红细胞表面结构进行敲打模式(Tapping mode)研究[7]表明：在细胞及纳米水平观察红细胞时不需要进行“金属包裹”处理，发现红细胞表面非常光滑，由许多紧密结合的纳米级颗粒组成。用AFM观察被细胞内皮素损伤的红细胞的三维图像，发现那些在扫描电镜下呈“窝头”状的红细胞是不对称的，而且金属硫蛋白对红细胞损伤有一定的保护作用,遗憾的是所获得的AFM图像不够清晰[8]。对于活细胞，也可以在AFM的液体池中进行动态的观察。通过液体池的进液孔可随时注入不同的化合物溶液，改变活细胞的液体环境(如离子浓度、pH值、温度、湿度等)进行动态的观测。

此外，其他应用AFM研究得较多的细胞包括肌细胞(心肌、骨骼肌、平滑肌等)、神经和神经胶质细胞、其他血细胞(淋巴细胞、血小板和巨噬细胞等)、纤维原细胞和内皮细胞、上皮细胞、细胞等。对培养细胞或肿瘤细胞,如腺癌细胞,L929细胞,RBL22H3细胞,F9细胞,MDCK细胞,牙骨质肿瘤细胞等,这些细胞都有了初步的研究。AFM也可用于探测微生物细胞的超微结构和细胞表面的物理特性[9-11]。Braga等[10]在生理条件下观察大肠杆菌受抗生素作用后的形态变化。

2．2 亚细胞水平成像的研究 在对诸如神经胶质细胞和血小板等进行研究的过程中，AFM能分辨出肌动蛋白纤维及其他骨架纤维[12]。AFM能够观察到细胞内的骨架结构，一种观点[13]认为可能是因为当探针扫过亚细胞结构的胞浆膜(原生质膜)时，胞浆膜本身发生变形、起皱，从而显示出亚细胞结构的轮廓；或者是探针插入胞浆膜而直接显示亚细胞骨架结构；而另一种观点[13]则认为是在细胞边缘细胞质较薄，因而探针能够对亚细胞骨架直接成像，不过确切的机理仍不清楚；但免疫化学及细胞松弛素B实验证实用AFM 观察到的纤维就是肌动蛋白纤维[12]。

细胞黏弹性主要依赖于细胞骨架，细胞在生理病理变化过程中会发生弹性的变化。如部分或完全激活的血小板，由于伴随着细胞骨架重排等变化，细胞弹性变化很大，所以可以通过测定细胞弹性的变化来推知细胞骨架的变化。利用AFM微悬臂的高度灵敏性，可以把细胞的病理生理反应转化成宏观上微悬臂的偏转-活细胞显微力学询问器，灵敏度极高[14]。Braet[15]等人对人的皮肤纤维瘤细胞和肝内皮细胞进行活体观察,观察到了细胞松弛素B作用后肌动蛋白细胞骨架的动态变化,探针在几小时内连续在细胞表面扫描,以观察到动态过程。这种活体观察使人们得到了以前在固定标本上得不到的信息。Jimenez-Garcia和 Fragoso-Sori-ano[16]等人利用AFM观察核膜、核孔、核仁和染色质等结构。

2．3 分子水平成像的研究

利用AFM对生物大分子的研究已经在众多的实验室广泛的进行。标本的载体可以是云母片、玻璃片或生物膜,但大多数选择云母片作为载体及轻敲模式。虽然生物大分子可在空气条件下成像,但是探针和样本分子表面难以避免有一层水膜致使扫描时探针受到毛细力作用,易使样本受到损坏,在缓冲溶液中成像可以在接近生理条件下观察生物大分子,但样本很难固定，分辨率也不高。目前大多数生物大分子的观察多在乙醇、丁醇等有机溶剂中进行。如果样本是DNA分子则一般需要加入一定量的二价阳离子(如Mg2+)。

AFM观察生物大分子的结构,分辨率高,可对被观察的大分子的长、宽、高等数据进行测量。例如Bu stam ante等用AFM观察质粒DNA的图像,可清楚的观测到环状DNA分子的三维结构,并可估计分子的高和宽度。后来,很多人进行DNA结构的观察,有人观察在不同的湿度下DNA构型的变化,如A2型、B2构型、Z2构型等。有些实验观察核小体结构,有些实验将DNA分子拉伸以测量DNA双螺旋的各种数据是否与理论值相符。Tiner Sr[17]等利用AFM观察到了三链DNA(H2DNA)结构,并描述说H2DNA在AFM观察下与双链DNA明显厚度不同,经过仔细测量发现H2DNA的结构与现有的理论模型很符合。

3 AFM的不足及临床应用前景

AFM也存在一些局限性。首先,其针尖是锥形的,使用一段时间后会变钝、尖端增宽,导致分辨率下降。在观察标本后针尖会被标本污染,再次使用需要清洗。并且针尖会对生物样本造成损伤。其次,在观察液态标本时,由于表面张力和静电斥力等因素会产生干扰信息,使得分辨率下降。

在新世纪的医学行程中我们看到，人类面临着疾病的威胁远远不能达到理想的征服水平，还必须向更深一步的微观世界进行探索。纳米科技研究的重要仪器AFM的微观表现和操纵技术将给医学带来变革。对AFM进一步改进的同时我们应该看到：用AFM一旦开展工作，带动一批研究项目，如细胞的一系列分子生物学研究(DNA、膜、离子通道、受休、基因、细胞因子等)，提高医学基础科研水平，为临床发展提供动力和线索:能够解决临床上的一些疑难的疾病诊断和鉴别诊断等问题，为指导治疗提供依据和思路。如果我们将细胞学、免疫学、分子生物学、生物物理学等与AFM技术有机地结合起来，将AFM和其他仪器设备(如透射电子显微镜、扫描电子显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、生物质谱、核磁共振、X射线晶体衍射等)有机地结合起来，相互补充、取长补短，一定会获得很好的研究结果。应用AFM这一把微观世界的钥匙，打开医学奥妙大门的日子已经离我们越来越近了。

参考文献

1 邓新宇,傅松滨.原子力显微镜在生物学中应用的现状与前景.国外医学遗传学分册,2003,26(3):134-137.

2 Binnig G,Rohrer H,Gerber C,et al.Surface studies by scanning tunneling microscopy.Phys Rev Lett,1982,49:57-61.

3 Binnig G,Quate CF,Gerber C.Related Articles,LinksAtomic force microscope.Phys Rev Lett.1986 Mar 3;56(9):930-933.

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17 Tiner WJ Sr，et al.J Mo l Bio l,2001,314(3):353-357.