小型动物实验性肝纤维及肝硬化动物模型的研究进展

肝纤维化是由于慢性肝病所致的持续或反复的肝实质炎症坏死而引起纤维结缔组织大量增生， 其降解失衡导致肝内过多胶原沉积形成肝纤维化，肝纤维化为肝硬化早期阶段。因此，慢性肝损伤动物模型的制备具有重要的研究意义。肝纤维化的防治是国内外研究的热点，国内外对该模型的研究较多，为此笔者对几种常用的肝纤维化模型复制方法、机制及该模型的优缺点加以综述。

1 化学性肝损伤动物模型

四氯化碳中毒模型是国内外最广泛应用的肝纤维化和肝损伤模型。将其溶于橄榄油、花生油等油溶液中，用浓度40% CCl4 ，按2mL/ kg体重给予大鼠腹腔注射，2次/w，共8w～4个月不等。单纯CCl4，一般采用30%～60%CCl4油剂皮下注射，剂量因动物种类而不同。小鼠采用1～3ml/kg体重，2次/w，肝硬化可在12～15w形成。该实验病理学改变8w出现早期纤维化症状， 12w时肝小叶结构破坏， 间质纤维组织增生， 有明显肝纤维化症状明显增多， 出现由再生肝细胞形成的假小叶。赵秋等[1]采用20%的CCl4死亡率为11%。可以使用多种方式，灌胃、腹腔注射、蒸汽吸入或拌于食物中口服等。吕明德等[2]采用饮食控制下，腹腔注射CCl4的方法制备犬肝硬变模型，也有较满意的效果。灌胃法优点在CCl4直接经门静脉到达肝脏，肝内最高水平1.5h后可达到，这种方式采用的较多。皮下注射CCl4形成时间较慢，不如灌胃法好，灌胃的缺点仍然是死亡率较高，有的高达到52.9%。许建明等[3]也采用CCl4和花生油混合液皮下注射，诱发小鼠肝纤维化模型，对不同期肝组织病理变化分析和肝脏生化指标的分析。结果发现，随造模时间延长，肝纤维化程度有逐渐增加的趋势。至造模后期，模型组动物的血清白蛋白比例明显下降，可能系肝纤维化进行发展的后果，亦说明该模型后期可导致肝功能失代偿。

1.2 二甲基亚硝胺致大鼠肝纤维化模型 二甲基亚硝胺（DMNA）是利用它所具有的肝毒性、基因毒性和免疫毒性，在动物体内的主要代谢为一种高反应活性化合物乙醛，可与体内生物大分子反应，破坏这些大分子的完整结构。低剂量长期应用可诱发肝肿瘤，大剂量可引起肝坏死和纤维化，常用二甲基亚硝胺，进入肝细胞经微粒体代谢生成乙醛损害肝细胞，同时产生活化的甲基，核酸与蛋白质甲基化致肝细胞坏死。大鼠按10mg/kg体重给予10g/L二甲基亚硝胺生理盐水稀释液， 腹腔注射共10次。用药8w大鼠可引起肝纤维化。该模型可用于研究肝硬化向肝癌转化机理。但由于是致癌物，实验中慎用，同时这一模型死亡率较高。

1.3 硫代乙酰胺（thioacetamide， TAA） TAA具有直接肝毒性作用， 长期给药可引起肝细胞的变性坏死甚至癌变。TAA常用于制作急性肝损伤、肝纤维化和肝性脑病模型。王春妍等采用皮下注射TAA600mg/kg制作大鼠急性肝损伤动物模型[4]。TAA可作用在肝细胞DNA、RNA和蛋白合成酶上产生毒性作用， 还可诱肝的代谢紊乱， 而致肝坏死王鹤桦等[5]用5%硫代乙酰胺（生理盐水配制， 过滤除菌）皮下注射， 2次/w， 共12w， 诱导肝纤维化。此模型具有良好的可行性和重复性、肝纤维化组织接近人类，制备成功率高等优点， 常用于制作肝纤维化和急性肝功能衰竭模型。

1.4 D-氨基半乳糖（D-galactosamine， D-Galn） 半乳糖胺致肝损伤的机制主要是干扰核酸及蛋白质的合成， 造成内毒素血症， 产生氧自由基及脂质过氧化导致膜机能障碍， 损伤线粒体致氧化磷酸化受损， 最终导致细胞死亡[6]。此外，D-GalN 也可通过破坏细胞内钙稳态而起作用。给药方式有皮下、腹腔内和静脉注射。病理学特点是似小结节性，结节为再生肝细胞团，由结缔组织包围，为多层网状纤维，可见胶原及弹性纤维。此种模型的症状、生化、组织学表现接近于人，重复性好，对肝纤维化、肝癌、肝衰竭、肝性脑病等研究有重要价值。但此法因 D-GalN 价格较高而使其应用受到限制。

2 免疫性肝损伤动物模型

2.1 腹腔注射异种血清 早在60年代就证明了免疫反应能引起肝损伤，异种动物血清或异体蛋白反复注入动物体内后，刺激动物形成过量的免疫复合物，抗原可用猪、牛、马血清、猪白蛋白、血清球蛋白，人γ球蛋白等反复注射，5w引起肝纤维化，10w引起肝硬化。国内王宝恩等[7]于1989年创立了良好的免疫性肝硬化模型，采用不同方法通过人血清白蛋白来制备鼠肝纤维化模型。该模型在发病机理上归属免疫损伤，与人类慢性肝炎所致的肝纤维化较相似，因此适合免疫方面肝纤维化发病机制的研究，但仍与人类病毒性肝炎免疫损伤所致的肝硬化有差距，因其没有病毒持续复制及肝实质持续损伤过程。

2.2通过腹部皮肤感染血吸虫法 动物如兔、小鼠感染血吸虫后所致肝纤维化与人类肝纤维化较为接近。通过腹部皮肤使动物感染血吸虫尾蚴，特别是小鼠被认为是研究纤维化因子剌激下胶原代谢等问题的最好模型。小鼠皮下注射曼氏血吸虫尾蚴后6～8w，肝脏形成肉芽肿， 肝超声显像检查，门脉区寄生虫卵的免疫反应引起的炎症，确定达到肝纤维化。此模型病变特殊，可用于研究血吸虫病性肝硬化，但不适于研究其它类型的人类肝纤维化。

2.3 卡介苗（ bacillus calmet te-guerin vaccine， BCG） 加脂多糖（lipopoly- saccha ride， LPS） BCG的损伤机制可能是小鼠注射BCG后导致多核中性粒细胞或巨噬细胞（肝内库普弗细胞）聚集于肝脏并被致敏， 继而用低剂量LPS攻击， 促进其释放大量对肝细胞有毒性作用的细胞因子，如白三烯、TNF、IL-1和NO等， NO作为自由基， 可以与O2- 反应生成超氧化亚硝酸阴离子（ONOO-） 以及其他自由基引起脂质过氧化造成肝细胞损害[8]。

2.4 尾静脉注射血清蛋白 该方法通过大鼠尾静脉注射人血清蛋白造成肝纤维化模型。2次/w，剂量从2.5mg开始，以后每周增加0.5mg，直至增加到4mg，复制模型时间为2个月。该模型复制成功率高、重复性好、自然恢复慢、不易自发逆转，且病理过程和形态学变化与人类肝纤维化及肝硬化相似，可用于筛选抗肝纤维化的药物。但该模型尾静脉注射操作要求高，反复注射可造成静脉炎症。以BCG浆液每只0.2mL（含>5×106菌）注射小鼠尾静脉，致敏后10d，再尾静脉注射LPS每只7.5ug，成功诱导小鼠肝损伤模型。确定BCG菌数 5.0×107+ LPS 剂量30ug/kg联合最佳，能够充分造成大鼠急性肝损伤[9]。BCG和LPS肝损伤动物模型简便易行，可用于对病毒性爆发性肝炎的研究。

3酒精诱导大鼠肝纤维化的模型

过度饮酒是人类肝纤维化的重要原因之一，其发病机理和治疗方面的研究也被大家所广泛关注采用，大鼠饮用40%乙醇[10]持续29w。结果表明，肝细胞坏死，肝脂肪变性，肝内形成中心性纤维化。乙醇能增加机体对胆碱需要量，有学者表明乙醇在伴有营养缺乏时才能进而形成肝硬化，近年来采用液体食物按热量配制，蛋白18%、脂肪21%、糖61%，其中糖的50%热量由乙醇代替。实验1～3年，1/3动物发生肝硬化。液体食物可完全控制食物与酒精的摄入量。缺点为因大鼠天生厌酒，对酒的代谢也较快，剂量过低模型不易成功，剂量过高死亡又增加，死亡率为30%～40%左右，实验周期长，可造成大鼠急性酒精性肝损伤。

4 胆汁性肝硬化模型

通过结扎、切断动物的胆总管， 造成胆管完全梗阻、胆汁排出受阻、胆管压力增高、肝内胆汁淤积， 从而引起肝细胞分泌功能障碍， 导致肝细胞坏死、增生，肝硬化形成，已在大鼠、兔等动物上取得成功。造模方法简单，操作安全无毒，周期短，大鼠6w左右即形成肝硬化门静脉高压。观察其胆道系统变化情况， 胆总管自狭窄以上呈不同程度扩张， 有的呈现串珠样扩张，。实验性胆汁性肝纤维化、肝硬化模型， 被认为是一种能模拟人肝纤维化的较理想动物模型。

5 多因素造模

5.1 CCl4加苯巴比妥 1969年首先由Mclean[11]使用于饮水中加入苯巴比妥（350mg/L），加CCl4蒸气吸入，以后有人改为CCl4灌胃，在饮用苯巴比妥2w后，灌胃，开始剂量为0.04ml，以后按体重增减调整CCl4用量，用此方法缩短了肝硬化形成时间，早期肝纤维化4～6w形成，8～10w形成肝硬化，死亡率仍在40%左右。此模型对可用于研究慢性肝硬化疾病代谢、免疫和生物学方面改变的进展。与单一运用CCl4相比，其方法简单，缩短建模时间，成模率高且死亡率低。出现病变分期明显，有助于研究外在因素对肝纤维化进程的干预作用。能造成持续性肝损伤，又不易引起急性肝功能衰竭。

5.2 CCl4加乙醇 乙醇与联合应用造模，两者相辅相成，乙醇能诱导P450活性从而增加CCl4的肝毒性，乙醇能加速肝细胞坏死，造模时间明显缩短。吴孟超[12]报道在大鼠腹腔注射5%起始浓度CCl4色拉油溶液，按0.1mL/kg剂量， 前2w 1次/w，第3w开始每隔3d 1次，从第3w开始药物浓度每2次提高2%，剂量维持在（0.1～0.2mL/kg），将10%乙醇水溶液为唯一饮用水。与乙醇合用使造模时间缩短，药物剂量减少，降低药物不良作用。此模型具有动物死亡率低、肝硬化成功率高和造模时间短等优点， 可较成功的模拟人酒精性肝硬化的小结节硬变。

参考文献：

[1]赵秋，但自力，李绍白.狗胆总管结扎所致肝硬化门静脉高压症的肝脏血流动力学改变[J].同济医科大学学报，1990，19（4）：217-220.

[2]吕明德，黄洁夫.腹腔注射四氯化碳配合营养控制制备犬肝硬化模型[J].中华实验外科杂志. 1993，10（2）：57.

[3]许建明，徐叔云.四氯化碳诱导小鼠肝纤维化模型的建立[J].中国药理学通报， 2000，16（3）：339-341.

[4]王春妍，杨世忠，江海艳.急性肝损伤大鼠肠源性内毒素血症形成机理及其作用的实验研究[J].临床肝胆病杂志，2007，23（2）：109-111.

[5]王鹤桦， 潘兴华，庞荣清，杨勇琴，刘建昆，刘金海.兔肝纤维化模型建立与自体骨髓干细胞移植的疗效.中国组织工程研究与临床康复 2008；12：8472-8476

[6]李宏涛，陈国民.D-氨基半乳糖研究的回顾和展望[J].肝脏，2004，9（3）：209-210.

[7]王宝恩，王志富，殷蔚荑，等.实验性免疫性肝纤维化的研究[J].中华医学杂志， 1989， 68（9）：503-505.

[8]陈象青，王钦茂，方华武，等.白芍总苷和当归提取物对小鼠免疫性肝损伤的保护作用[J]. 承德医学院学报，2004，21（1）：8-10.

[9]邱英锋，缪晓辉， 蔡 雄.卡介苗加脂多糖建立的大鼠急性免疫性肝损伤模型的研究[J].西北国防医学杂志，2004，25（5）：345-347.

[10] Keegan A， Martini R， Batey R. Ethanol-related liver injury in the rat： a model of steatosis in flammation and pericentral fibrosis[J].J Hepatol，1995，23（5）：591-600.

[11]Mclean E，Mclean AEM，，Sutton PM. Instant cirrhosis， An improved methold for producing cirrhosis in rats by simultaneous administration of carbon tetrachloride and phenbarbitone [J].Br J Exp Pathol，1996，50（3）：502-510.

[12]吴孟超，杨广顺.大鼠肝硬化模型复制的研究[J].中华实验外科杂志， 1994，1（4）：146-148.