Pb2+胁迫对冬凌草种子萌发和幼苗生长的影响

[摘要] 以冬凌草种子为材料，研究铅（Pb2+）溶液（0， 135， 270， 540， 1 080 mg・L-1）对冬凌草种子萌发和幼苗生长的影响。结果表明：①低浓度Pb对冬凌草种子萌发无显著影响，Pb质量浓度135 mg・L-1条件下的种子发芽势高于对照，发芽速度快于对照，但差异均不显著；中高质量浓度Pb （270～1 080 mg・L-1）对种子萌发有显著的抑制效应， 随着Pb浓度的升高，种子发芽率、发芽势和发芽指数呈递减趋势，均显著低于对照（P

[关键词] 重金属；Pb胁迫；冬凌草；种子萌发；Pb生物富集

据2014年全国土壤污染状况调查公报显示，中国土壤污染总超标率16.1%，其中耕地点位污染物超标率为19.4%，主要污染因子为重金属[1]。重金属污染问题作为影响我国农业发展、食品安全、药品安全、生态环境质量问题的重要因素引起社会广泛关注[2-5]。

重金属污染胁迫也是影响植物生长的逆境因素之一[2-3，6]。植物耐重金属的机制，如何提高植物的耐重金属能力，减少重金属对作物的污染，增加重金属胁迫下的作物产量等，成为人们关注的热点问题。重金属铅（Pb）难降解、易蓄积、毒性大，对中药材生长、产量和品质都有影响[4，6]。过量铅不仅会阻滞植物生长，而且能在植物体内蓄积，进而通过食物链进入人体造成伤害[6]。目前对于重金属污染胁迫种子萌发的研究主要在大宗农作物品种方面，缺乏对重金属在植物体内富集效应的研究，在中药材领域研究更少。冬凌草Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara C. Y. Wu et Hsuan.为多年生草本或亚灌木，是我国20世纪70年代新发现的天然抗癌植物[7-8]。近年来随着进一步开发利用，野生资源日益枯竭，人工栽培面积逐年扩大，重金属铅（Pb）污染风险加大。目前，冬凌草引种区域土壤Pb在30～600 mg・kg-1，其中81.5%符合GB15618土壤质量二级以上标准（按土壤pH不同设置Pb上限为250～350 mg・kg-1），18.5%的土壤中Pb含量超出二级土壤限量标准；22%药材出现Pb含量超标。

本研究试验不同浓度Pb2+对冬凌草种子萌发的影响程度，探讨冬凌草在该时期的Pb生物富集规律及其对幼苗生长的影响，并通过回归分析，建立Pb与种子发芽率、与生物量的拟合模型，预测冬凌草耐受Pb的临界浓度。研究Pb胁迫对种子萌发和幼苗生长的影响，为冬凌草种植地选择及铅污染土壤改良提供理论依据；而对幼苗中Pb富集及其临界值的研究，可用以评价冬凌草的耐铅性。

1 材料

冬凌草种子，幼苗。经中国农业大学郭玉海教授鉴定为唇形科香茶菜属植物碎米桠R. rubescens [Hemsl.] Hara。

冬凌草种子于2013年11月采自河南济源市愚公家珍科技公司王屋山冬凌草基地。阴干净选，室温保存。种子Pb质量分数背景值为2.10 mg・kg-1，千粒重0.596 g。预实验种子发芽率63%。

乙酸铅[Pb（CH3COO）2・3H2O]分析纯，购于汕头市西陇化工厂有限公司。

2 方法

2.1 试验设计

采用乙酸铅[Pb（CH3COO）2・3H2O]溶液对冬凌草种子萌发和幼苗生长进行胁迫试验。设4个水平，Pb质量浓度分别为135，270，540，1 080 mg・L-1（以Pb2+ 质量浓度计）。以蒸馏水处理的种子为对照。共5个处理，每个处理设4个重复。

2.2 种子发芽试验

称取大小均匀一致的冬凌草种子2 g。先经10% H2O2冲洗、浸泡20 min消毒杀菌，然后用蒸馏水充分清洗。每个培养皿（直径9 cm）用H2O2消毒，蒸馏水洗净，放置2层滤纸，注入等量Pb溶液或蒸馏水。将种子置于带滤纸的培养皿，进行不同浓度Pb胁迫发芽试验。每皿均匀放置50粒种子。置于恒温光照恒温箱，温度控制（25±2） ℃，光照强度6 600 lx （400～750 nm），采用光暗交替（12 h・d-1光照）。

试验方法：每天向培养皿中补充蒸发去的溶液，称重法补水，保持溶液浓度恒定。

每天上午检查种子萌况，记录发芽数。放置种子当日计为第0天。由预实验可知冬凌草种子发芽较快，6 d内可全部萌发，由此选择测定6 d发芽率； 第3天达到发芽高峰，故选择3 d测定发芽势。计录发芽至第6天结束，每个重复随机抽取10粒发芽种子，测量胚芽长、胚根长、幼苗鲜重。

2.3 Pb含量测定

以发芽试验结束当天的冬凌草幼苗为材料测定植株的Pb含量。

样品消解采用微波消解仪。将各处理的幼苗分别用去离子水反复冲洗，然后用滤纸吸取表面水分。每个处理各取0.1 g样加入消解罐的内衬杯中。加入10 mL HNO3， 密封置于消解仪中，静置过夜，24 h后消解。消解条件：5 min内消解罐室温加热至130 ℃，接着在5 min内由130 ℃提高到175～180 ℃，并保持20 min。经40 min冷却后转入50 mL量瓶，加入去离子水定容。同时做空白对照。

Pb含量（质量分数）采用等离子发射光谱仪ICP-AES测得。

2.4 数据处理

采用种子发芽势、发芽率、平均发芽速度、发芽指数对冬凌草种子萌发特征进行描述，用胚芽长、胚根长、幼苗生物量鲜重、活力指数对幼苗的生长特征进行描述[9-12]。

发芽势（GP） =∑nmax/N×100%，式中，nmax为种子达到发芽高峰时的发芽粒数

发芽率（GR）=第6天统计种子发芽数/供试种子数×100%

相对发芽势（GVP）=Pb处理发芽势/对照发芽势×100%

相对发芽率（GRP）=Pb处理发芽率/对照发芽率×100%

平均发芽速度（GS） =∑（D*n）/∑n，式中D为从种子置床起算的天数，置床当日为0；n为相应各天的发芽粒数。

发芽指数（GI）= ∑（Gt/Dt），式中Dt为发芽日数，Gt为与Dt相对应的每天发芽种子数。

相对发芽指数（RGI）=铅处理发芽指数/对照发芽指数×100%

活力指数（VI）=第6天幼苗总鲜重/种子发芽数

相对活力指数（RVI）=Pb处理活力指数VI/对照活力指数VI×100%

Pb生物富集系数（BCF）= 植株中Pb浓度W/处理溶液Pb浓度P，式中W和P的单位分别为mg・kg-1，mg・L-1

利用Excel 2010对试验数据进行初步计算。用最小二乘法进行模型的拟合，并对拟合的回归方程进行验证、分析；对实验数据进行方差分析，以Duncan法进行处理间的多重比较（α=0.05）。所有的数据统计、分析工作均在SPSS 12.0统计软件中进行。

3 结果与分析

3.1 Pb胁迫对冬凌草种子发芽的影响

根据试验设计方案，得到冬凌草种子的发芽势、发芽率、平均发芽速度和发芽指数，见表1。

本试验表明，低浓度Pb对冬凌草种子早期萌发无显著影响， Pb质量浓度135 mg・L-1条件下的种子发芽势高于对照，发芽速度快于对照，但差异均不显著；中高质量浓度Pb（270～1 080 mg・L-1）对种子萌发有显著的抑制效应， 随着Pb浓度的升高，种子发芽率、发芽势和发芽指数呈递减趋势，均显著低于对照（P

发芽率（Y）和Pb浓度（X）之间存在较为明显的线性关系（Y=60.45-0.030 7X， R2=0.799 2，P

Pb胁迫对冬凌草种子发芽指数的影响方面： 低质量浓度Pb（135 mg・L-1）和中质量浓度Pb（270 mg・L-1）与对照相比有所下降，但差异不显著；540，270 mg・L-1处理相比， 二者的发芽指数差异不显著；其余各处理之间发芽指数均有显著差异，高质量浓度Pb（540，1 080 mg・L-1）胁迫下，冬凌草种子发芽指数显著下降，分别比对照低24.65%，53.66%。

Pb胁迫对冬凌草种子平均发芽速度的影响方 面：低质量浓度Pb（135 mg・L-1）胁迫下，平均发芽速度略快于对照，但差异不显著；中质量浓度Pb（270 mg・L-1）铅胁迫下，平均发芽速度显著快于对照；高质量浓度Pb（540～1 080 mg・L-1）条件下，平均发芽速度的值显著大于对照，冬凌草种子平均发芽速度显著降低（P

3.2 Pb胁迫对冬凌草幼苗生长的影响

本试验中，冬凌草幼苗的胚根长、胚芽长、生物量鲜重和生长活力指数随Pb浓度的升高递减，中高浓度Pb（270～1 080 mg・L-1）对幼苗生长有显著抑制效应（P

3.2.1 Pb胁迫对胚根和胚芽生长的影响 从表2可以看出，Pb胁迫下，胚根长和胚芽长均小于对照组，胚根随Pb浓度的增加而变短，高质量浓度Pb（540，1 080 mg・L-1）胁迫下，胚芽和胚根的长度比分别为4.16∶0， 3.81∶0， 胚根几乎未现分化，说明Pb胁迫对冬凌草种子胚根和胚芽生长具有抑制作用，而胚根是对Pb 胁迫较敏感的部位。冬凌草幼苗胚根长和胚芽长分别比对照低43.09%～100%，44.43%～84.36%。

3.2.2 Pb胁迫对冬凌草生物量鲜重的影响 从表2可以看出，低质量浓度Pb（135 mg・L-1）胁迫下，冬凌草幼苗生物量与对照之间差异不显著，其余各处理之间差异显著，说明中高质量浓度Pb（270～1 080 mg・L-1）对冬凌草种子萌发后的生长具有明显的抑制作用，生物量比对照低26.89%～60.05%。

生物量（Y）和Pb浓度（X）多项式之间存在较好的拟合关系（Y=38.862-0.045 7X+0.000 022X2， R2=0.899 9， P

3.2.3 Pb胁迫对冬凌草幼苗生长活力指数的影响 随Pb浓度升高，活力指数呈明显下降趋势，各处理之间的活力指数均有显著差异。说明Pb胁迫对冬凌草幼苗的生长活力具有明显的抑制作用，4个Pb质量浓度（135， 270， 540， 1 080 mg・L-1）条件下的活力指数分别比对照低11.06%， 25.07%， 47.80%，64.87%，呈明显递减趋势。

3.3 Pb胁迫下冬凌草种子相对发芽势、相对发芽率、相对发芽指数和相对活力指数评价

本试验中，随Pb浓度的升高，相对发芽势、相对发芽率、相对发芽指数和相对活力指数均呈递减趋势，抑制程度递增，且不同处理之间差异显著；除相对发芽势在低Pb（135 mg・L-1）胁迫下为促进效应外，270～1 080 mg・L-1Pb胁迫下，各指标均表现为抑制效应（P

3.4 Pb在冬凌草幼苗中的富集及其与生长的相关性

3.4.1 冬凌草幼苗对Pb的吸收和富集特点 本试验中，对照组（CK）中冬凌草植株Pb质量分数值应为背景值，Pb吸收系数理论值设定为0。试验结果表明，冬凌草种子萌发期Pb吸收系数为0.76～2.59，随Pb溶液浓度增高而增大；冬凌草中Pb富集量（Pb质量分数）随Pb处理浓度的提高而显著增加，不同处理间的Pb富集量均差异显著（P

冬凌草植株中Pb质量分数（Y）与Pb处理浓度（X）间存在非线性关系，模型为Y=3 361.73-3 330.48/[1+（X/637.24）3.01]， （R2=0.993， P

3.4.2 冬凌草幼苗中的Pb富集与生物量的关系 从表2，4看出，冬凌草幼苗中Pb富集值越高，其生物量越低。

模型拟合显示生物量（Y）和冬凌草Pb质量分数（富集量）（X） 的多项式之间存在较好的拟合关系（Y=35.668-0.017 2X+0.000 003X2，R2=0.862 2，P

冬凌草Pb质量分数（富集量）与生物量之间呈负相关，说明Pb生物富集是抑制冬凌草幼苗生长的主要原因。

4 讨论

冬凌草耐铅性决定其在不同浓度Pb胁迫下能否成功建苗。研究Pb对种子萌发的影响，可以较早反映植物在重金属污染环境中的危害，也可作为环境污染评价的主要依据之一[1-2，11]。重金属胁迫对种子萌发和幼苗生长影响的研究成为近年来植物逆境生理研究热点之一。

重金属对植物种子萌发的影响，一般认为存在较低浓度下的刺激效应和高浓度下的抑制效应[5]。本试验中，低浓度Pb对冬凌草种子初始萌发有所促进，发芽势略高、平均发芽速度略快于对照，但与对照间差异不显著，说明冬凌草有一定的耐铅能力。随着Pb浓度的升高，发芽势、累积发芽率、平均发芽速度、发芽指数均出现下降。本试验这一结果与前人[6，14-17]的研究结论基本一致，但对Pb浓度的反应结果并不一致，说明不同植物种子萌发的耐铅能力有较大差异[16]，这是由物种的遗传基因决定的。

Pb胁迫下，冬凌草种子萌发后，其胚芽、胚根伸长均受到抑制，其中对胚根的抑制作用较胚芽强。主要原因是Pb作为有毒污染物在幼苗富集后生长发育受阻。胚根最早和直接接触重金属污染源，对Pb污染的反应最敏感，是最先、最直接受害的器官；还可能由于种子萌发后，胚根最先突破种皮吸收，胚根内Pb富集较多，受胁迫时间也比胚芽较长。Pb对胚根的毒害可能是通过抑制胚根细胞的有丝分裂，从而抑制胚根的伸长生长。这与前人的研究结果相似[18-23]，但之前的研究中均缺乏Pb生物富集与苗期生长的相关性研究。种子萌发后，对重金属Pb的吸收蓄积量逐步增加，抗性逐渐降低，其生长抑制程度逐渐加强；低浓度的Pb虽在早期对冬凌草种子萌发没有明显抑制，但随着时间延伸，后期生长的抑制效应逐渐获得表现。冬凌草幼苗Pb富集系数随Pb溶液浓度增高而增大；冬凌草中Pb质量分数随Pb处理浓度的提高而显著增加，二者与生物量均呈负相关。Pb生物富集影响幼苗正常生理代谢，抑制生长，导致生物量下降。

经对拟合模型预测分析，比对照发芽率和生物量降低10%的Pb临界质量浓度分别为195.18，101.65 mg・L-1，比对照生物量降低10%的植株中的临界Pb质量分数为288.86 mg・kg-1。模型经检验，拟合度良好，具有普遍使用意义。

本研究为重金属铅（Pb）对冬凌草种子萌发期毒性提供了评价依据，为冬凌草种植地科学选择及生产过程调控提供了理论依据。

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Effects of Pb2+stress on seed germination & seedling

growth of Rabdosia rubescens

KONG Si-xin1，2， SU He1， ZHAN Yan-ting1， LI Hai-kui3， CUI Xu-sheng1， GUO Yu-hai1*

（1.College of Agriculture and Biotechnology， China Agricultural University， Beijing 100193， China；

2.Shining-Herb （Beijing） International Bio-Tech Co.， Ltd.， Beijing 100073， China；

3.Research Institute of Forest Resource Information Techniques， China Academy of Forestry， Beijing 100091， China）

[Abstract] The seeds of Rabdosia rubescens were as the materials to research the impacts of different lead （Pb2+） concentrations（0， 135， 270， 540， 1 080 mg・L-1） on seed germination and seedling growth. The results show that： Low concentration of lead had no obvious effect on early germination of the seed， the germination vigor and germination speed were lightly higher but not significantly differed at the level of Pb concentration 135 mg・L-1 with control group； Mid-high concentration of Pb solution（270-1 080 mg・L-1） significantly inhibited the seed germination and seedling growth， which reduced the seed germination rate， germination vigor， germination index， embryo root length and shoot length， growth index with increasing of Pb concentrations. There was a inhibitory effect on embryo shoot length and root length at mid-high lead concentrations stress， and stronger inhibitory effect on root ， which was more sensitive than shoot to Pb stress（P

[Key words] heavy metal； Pb stress； Rabdosia rubescens； seed germination； Pb bioaccumulation

doi：10.4268/cjcmm20142125