时间：2023-11-13 05:16:33
这也意味着他可以放心地做手术而不必担心术后腹水了。
“太难买了，北京的药店都跑遍了，还通过关系找了其他医院，都说缺货。”王先生的家人说。
目前，在全国绝大部分医院中，癌症术后、烧伤病人等患者的“救命药”――人血白蛋白全线缺货。别说规格低一些的医院，就连三甲医院的存药也极度紧张，都是控制着给必须注射的病人使用。遇到特别危重的病人，院方只能亲自出面求厂家卖一点儿，而这些厂家往往不是中标厂家，医院还需要对其进行资质审查。有时，“有能耐”的病人家属也能从外地医院或市场弄来一些白蛋白。在医院供不应求的同时，网络上贩卖人血白蛋白的信息却铺天盖地，而且许多贩卖者都宣称自己的药品是从正规大医院“走后门”弄到的，让人难辨真假。
同时，大量假人血白蛋白流入血液制品市场，从2007年3月开始，国家食品药品监督管理局在全国范围内展开了人血白蛋白药品专项整治行动。吉林省食品药品监督管理局对7个医疗机构使用的36个批次的人血白蛋白进行监督抽检时，发现蛋白质含量全部为零，包装标志为“北京天坛生物制品股份有限公司”和“德国杰特贝林制药有限公司”等5家企业生产的这7个批次的人血白蛋白产品为假药。
据国家食品药品监督管理局介绍，开展人血白蛋白等生物制品的专项整治行动以来，各地食品药品监管部门已经陆续在吉林、山西、湖北、湖南、宁夏、青海、重庆等地查获了一批假冒的“人血白蛋白”药品，并立即采取了控制措施，吉林省22个批次的假冒人血白蛋白被查获，18家使用假人血白蛋白的医疗机构被查处。有关犯罪嫌疑人已经移交公安机关。
人血白蛋白是用来临床急救的特殊药品，如果出现假冒，将会贻误急症患者的治疗，导致病情恶化，严重的会引起过敏休克死亡。“救命药”竟是“致命药”，令人不寒而栗。这些假药是如何堂而皇之地进入医院，又进入患者血液中的呢？
究竟是什么原因造成了人血白蛋白的全线告急？假人血白蛋白何以泛滥成灾？网上售卖的制剂质量又有几成可信？种种疑问不禁让我们有些担心：人血白蛋白，你究竟怎么啦？
认识人血白蛋白
人血白蛋白(简称白蛋白或ALB)，是一种“救命药”，主要用于治疗失血创伤引起的休克，脑水肿、肝硬化及肾水肿或腹水，癌症患者和急需补充营养的重症患者，用量也很大。
人血白蛋白是临床上常用的血浆容量扩张剂之一，它是取新鲜血浆或保存期不超过2年的冰冻血浆，用低温乙醇蛋白分离法分段沉淀提取白蛋白组分，经超滤或冷冻干燥脱醇,浓缩等工序制得。然后加灭菌注射用水按照规定的蛋白质浓度配制成溶液，加适量稳定剂，进行60℃灭活病毒至少10小时,分装后置20～25℃至少4周，或30～32℃放置至少14天，逐瓶检查外观应符合的规定。人血白蛋白为黄色或绿色至棕色略黏稠的澄明液体；不应有异物、浑浊或沉淀。白蛋白运输方便，制备简单，输注时不良反应少。能将组织中多余液体吸收到血液循环中，使动脉压升高，维持血液动力学平衡和血管内渗透压，补充血管内、血管外的白蛋白短乏，增加血浆总蛋白量，治疗蛋白缺乏症。可用于因血容量过低而引起的休克，失血创伤、烧伤引起的休克，脑水肿及损伤引起的颅压升高，新生儿高胆红素血症，急性肝功能衰竭；能解毒，即与游离的氨基酸相结合，减轻氨毒；并可用于体外循环、血浆置换等。
人血白蛋白一般在2～8℃的暗处保存，有效期5年。
人血白蛋白，告急！
“人血白蛋白，你们这里有吗？”一大早，从浦东赶到市区某三甲医院药房的李女士焦急地询问，当被告知“暂时无货”时，李女士只能无奈继续赶往下一家医院寻找。李女士的母亲已经80岁高龄，正在一家医院急诊观察室抢救。为了买到这个救命药，她已经在外奔波了好几天却仍然一无所获。
李女士的遭遇实际上并非个案。近期，人血白蛋白、丙种球蛋白等血液制品断货的消息已经在不少病人中传了开来。由于货源告急，医疗机构开始严格控制这两类血液制品的使用。
医院：癌症病人都排不上队使用
记者以替朋友求购人血白蛋白为名拨通了医院的电话。“人血白蛋白啊，没有了，已经用完了，我们也想进点货”，一家中医医院的负责人告诉记者；“现在除了车祸外伤抢救的病人外，其他病人我们都不用人血白蛋白了，因为货源非常紧张”，另一家全国知名的三甲医院表示；“这个药这么紧张，像我们这种小医院早就没有了，就算市里有一点，也都是调配给大医院的”，一家区级医院药剂科科长表示。一个上午，记者接连联系了十余家医院，都被告知没货。目前医院急诊使用人血白蛋白和球蛋白的原则是，优先给交通事故或其他重大外伤事故后大出血、肝硬化病人晚期抢救等为数不多的几种急重症使用。华东医院药剂科负责人宋钟娟表示，该院医生处方人血白蛋白要经医务处签字，没有签字不能开方。“过去把人血白蛋白用来给癌症病人辅助治疗或者手术后促进机体恢复，而现在这样的情况就基本不用了”。至于为何要对血液制品使用如此严格，这位负责人解释说，以往每月该院都要使用500-1000支人血白蛋白，而最近几个月每月进货最多只有300支，供应跟不上需求的增长。
“过去我们医院多的时候每天就要用掉几百支人血白蛋白”，某医院一位负责人告诉记者，在该院重症监护室的病人中80%以上都需要用人血白蛋白来挽救生命；肿瘤病人手术后依靠人血白蛋白来维持体内蛋白需求水平，如果术后长时间处于低蛋白状态，则并发感染和其他并发症的可能性很大，而感染和并发症对大型手术后的病人可谓致命。至于烧伤病人和其他外伤病人需要使用大量人血白蛋白，则更是常见现象。
上海交大医学院附属胸科医院肺内科里住的大量是需要手术的中晚期肺癌病人。病人手术中会丢失较多的血液和蛋白，术后恢复也需要用蛋白来愈合、修复创口，低蛋白病人更容易出现术后多种并发症和严重感染甚至死亡。现在，这些医院都告诉记者，为了购买人血白蛋白，工作人员压力非常大，目前缺口达到三分之二。为了保证术中大出血病人抢救时的用药，这些医院对于大型手术后病人除非特别危险，一般都不开人血白蛋白处方，只能让病人在低蛋白的状态下依靠抗生素和个人免疫力来度过感染关口。
北京天坛医院有关负责人表示，他们的情况已经不能用“紧张”一词来形容。“招标招不进来，根本就没有库存！”民航总医院有关负责人无奈地说，遇到特别危重的病人，院方只能亲自出面求厂家卖一点儿，而这些厂家往往不是中标厂家，医院还需要对其进行资质审查。有时，“有能耐”的病人家属也能从外地医院或市场弄来一些白蛋白。“但这些手段只能缓一时之困，不是长久之计。”
患者及家属的迷信和滥用，
造成了“蛋白荒”的持续
另一个值得注意的现象是，我国长期以来形成的用药观念，直接导致患者对人血白蛋白的迷信和滥用。
不久前，在呼和浩特市一家社区门诊，一位母亲领着即将参加高考的女儿前来注射人血白蛋白。这位姓齐的母亲说，女儿平时就身体虚弱、免疫力低下，临近高考更是整日无精打采、容易感冒、经常喊累。“听其他考生家长说，人血白蛋白能提高免疫力，所以就四处托人，高价买了一支，准备给孩子注射。”齐妈妈说，“女儿的同学中不少人都打算或已经注射了人血白蛋白。”为让孩子考出好成绩，家长们只能想方设法给孩子增加营养，导致一些家长“病急乱投医”。
医药供货商手里也没货
不仅医院缺，一些医药供货商也头疼。“前一段时间，外地一支人血白蛋白从180元涨到400多，本地有人愿意每支多出100元，可我就是弄不到货。”甘肃驻合肥的一家药商代表孙先生说。南京医药合肥天星有限公司，这家目前在江苏省属于较大的医药供应企业，对人血白蛋白也是连称“缺货。”
“救命药”告急并非个别省市独有，是全国普遍现象。据专家介绍，这与前几个月出现的市场狂犬疫苗紧缺原因有类似之处，国家实行生物制品批签发制度，保证了生物制品的质量，但同时也延缓了上市周期。白蛋白紧缺的背后还有血浆原料的紧缺和市场需求不断增长的矛盾，我国现有30余家血液制品生产企业，年生产人血白蛋白能力达3000万支左右，但由于受到原料血浆供应的制约，实际生产总量约1300万支。采访中，有本地知情者也认为，货源紧张也不排除人为因素影响。
救命药“人血白蛋白”奇缺之谜
人血白蛋白为什么会如此紧缺？假人血白蛋白何以泛滥成灾？一位业内人士告诉记者，人血白蛋白的售价每瓶250元至330元不等，而每瓶假药成本不到10元钱，“巨大的暴利空间是假药泛滥的关键因素。”该人士认为，有关部门针对血液制品实行的一系列管控措施，也是导致真药市场缺口过大，假药泛滥的重要诱因。”
价格控制 事与愿违
记者在采访中了解到，今年1月26日国家发改委下调人血白蛋白的最高零售价后，各地医院即开始出现药品供应紧张状况。此后，国家发改委要求各地分析供应紧张原因，可以根据成本变化等制定临时价格。
北京市发改委在对本市情况进行调查后，制定了19种规格的人血白蛋白临时最高售价。其中最贵的为瓶装20克（冻干粉），每瓶价格为524元，最低的为每支89元，其余均在180元至524元之间。北京市发改委要求，各医疗机构以最小零售包装的实际采购价为基础，顺加不超过15％的加价率作价，实际采购价高于500元的，最高加价额不得超过75元。
同时，各地也根据自己的情况，对人血白蛋白的最高零售价进行了相应的调整。但不论怎样调整，各地在零售价格方面都进行了严格限制。
在职能部门“有形之手”的调节下，人血白蛋白的利润空间被大大压缩。今年三四月以前，人血白蛋白卖280元/瓶左右，“五一”前，价格涨到310元/瓶，目前则已接近330元，却仍供不应求。
“按国家要求正规生产白蛋白是有利润，但比起以前，利润空间低多了。医院自己拿15%不变，由于企业成本增加，产品的定价却不变，导致只能在流通环节压缩商的利润。”一位业内人士透露说。根据有关规定，生物制品必须由有资质的商销售，而这几年查出的假药，几乎全部来自商的个人渠道。
企业无奈 开工不足
2006年开始，国家对单采血浆站转制改造，一些管理不完善的血站被关闭，全国采浆量一路下滑。
2007年3月，药监局印发2007年血液制品疫苗生产整顿实施方案。针对当前血液制品、疫苗生产中存在的血浆来源合法性、生产工艺质量控制和销售等问题，决定开展血液制品、疫苗生产的整顿工作。
整治措施规定，血液制品生产企业应适时建立原料血浆投料前的检疫期制度，将采集并检测合格的原料血浆放置90天，经对献浆员的血浆样本再次进行病毒筛查并检测合格，方可将原料血浆投入生产。而且，血液制品生产企业应当在2007年12月31日前建立原料血浆投料前的检疫期制度。
某生物制品企业负责人对此颇有微辞：“这种规定意味着，一个人今天献浆，我们不能直接采用，要低温保存3个月后，再找到这个人再做一次检查，如果这次检查合格，此前几次的血浆才能用。而现实情况是，像河南、安徽、广西等地农民的流动性非常大，找不到这个人，血浆只能销毁。”
雪上加霜的是，有关部门在执行政策过程中矫枉过正。一家生物制品公司负责人告诉记者，尽管国家规定血液制品生产企业最迟可以在今年年底前建立原料血浆投料前的检疫期制度，但各地药监部门大都已提前部署实施这一政策，这直接导致人血白蛋白的生产原料――血浆在几个月内急剧减少，因此市场上出现人血白蛋白脱销的现象也就不足为奇。
一位业内人士告诉记者，但今年血浆供应量将减少1000吨左右。与此同时，血浆价格也由原来的25万元/吨涨到目前的35万元/吨左右，有的价格甚至高达40万元/吨。
由于血浆原料紧缺，大多数企业无法满负荷生产。深圳卫武光明生物制品有限公司有关负责人表示，该公司的产能仅仅利用了40%。而在假人血白蛋白泛滥的吉林，具有合法资质的长春生物制品研究所，却因血浆源短缺已经停产白蛋白。
药品紧缺 暂难缓解
尽管市场反应强烈，但有关部门的整顿措施并未画上句号。国家药监部门决定，到2008年1月1日，所有上市销售的血液制品都要实施“批签发”，并派驻驻厂监督员。
在业内人士看来，这些措施无疑会加剧人血白蛋白短缺的现状。对此，药监局有关人士表示，我国现有33家血液制品生产企业，实际年生产人血白蛋白能力可达3000万支左右，但由于受到原料血浆供应的制约，人血白蛋白年生产总量约1300万支（按10克白蛋白/支计算）。如果医疗机构严格按照适应症用药，首先满足急需患者，目前的产量还是能够满足临床的基本需求。该人士还表示，在国家有关部门综合整治后，我国血液制品市场秩序将进一步好转，由一系列整顿政策而导致的人血白蛋白紧俏的局面将会缓解。
一位业内人士对记者评价说，有关部门整顿市场的初衷无疑是好的，从长远来看也非常必要，但就目前所暴露出的问题而言，如何缓解整顿政策“磨合期”所产生的“阵痛”，保障群众用药安全，值得有关部门反思。
（据《市场报》）
走出白蛋白使用误区
许多人将医疗上常用的白蛋白制剂当作营养品使用，认为白蛋白营养丰富，可以防病治病、增强体质，一旦觉得自己体质虚弱、精神不振或有其他不适时，便要求医生为自己输注白蛋白。实际上，临床上使用白蛋白具有严格的适应症，把它当成包医百病的万能药或补品是不对的。夸大白蛋白作用的误区主要有以下几个方面：
误区一：增强机体免疫力
白蛋白与免疫球蛋白分属不同种类的蛋白，球蛋白与机体的各种免疫功能息息相关，而白蛋白并不参与机体抗体的形成，增强机体免疫力纯属无稽之谈。并且在大剂量输注时，白蛋白制剂中的若干生理活性物质，偶有可能引起机体免疫功能下降。
误区二：提供丰富营养
对于正常人来说，应用白蛋白补充营养与吃普通高蛋白食品并没有什么差别，过多应用反而弊多利少。因为白蛋白不仅缺乏一些人体必须的氨基酸，而且白蛋白输入人体分解后，再利用率相当低，并可能促进自身原有白蛋白的分解。美国联合保健联盟（UHC)标准也指出“对于需要营养支持的病人来说，白蛋白不能作为蛋白质的补充来源”。
误区三：广泛用于各种危重病人的救治
目前，并没有证据表明，白蛋白的使用对危重病人的救治具有明显作用，仅在一些脑梗塞的实验研究中提示可能有一定的作用。因此，应用白蛋白并不能改善疾病的预后，而现在很多医生或患者家属把白蛋白作为一种万能药用到各种危重病人身上，不但增加了额外的医疗支出，甚至可能加重病情，得不偿失。
此外，所谓“传播肝炎、艾滋病”的担心完全没有必要。目前使用的人血白蛋白，是在有稳定剂时经60℃10小时加温灭活病毒，在这种条件下HBV、HCV、HIV等病毒均已丧失传染性；且白蛋白无抗原性，可反复输注，比输注血浆或全血安全很多。
白蛋白作为药品，应用应由医生掌握，没有医嘱不能擅自使用。对白蛋白有严重过敏史、高血压患者、急性心脏病患者、正常血容量及高血容量的心力衰竭患者、严重贫血患者、肾功能不全患者等，白蛋白都是禁用或至少是慎用的。千万不要因为盲从而踏进滥用的陷阱里，否则失去的不仅仅是金钱，还有您的健康。
（据《家庭保健报》）
解决人血白蛋白紧缺的根本是发展无偿献血
2007年5月，山东烟台一名患者使用假人血白蛋白后不治身亡；6月，吉林省查出18家正规医院使用假人血白蛋白。而国家食品药品监督管理局从今年3月开始的专项调查显示，大量假人血白蛋白以零散数目进入基层医疗机构。
越是紧俏的商品，市场上便越是涌现大量的假冒伪劣“替身”，这几乎成了一种不成文的规律。人血白蛋白俏得很，一是因为它有疗效，病人家属和医生都乐意用；二是因为它的原料――人的血浆来源很有限，使得这一药品的产量也很有限。在需求十分旺盛而供给极为不足的市场背景下，假冒的人血白蛋白便应运而生，半明半暗地泛滥于市。
针对这一问题，9月初，国家食品药品监督管理局新闻发言人颜江瑛表示，为了保证血液制品和疫苗的安全性，明年1月1日起，我国将对所有上市销售的血液制品实施批签发。并且，从2008年7月1日起，对血液制品生产用原料血浆实施“检疫期”制度。即将采集并检测合格的原料血浆放置90天后，经对献浆者再次进行检查并合格后，方可将90天前采集的原料血浆投入血液制品的生产。
针对目前人血白蛋白的短缺问题，颜江英说，这主要是原料血浆不足造成的。由于原料血浆不足，不少血液制品生产企业难为“无米之炊”，纷纷出现停产。人血白蛋白的产量，2005年是117089公斤，2006年是126723公斤，2007年到现在只有47991公斤。市场上人血白蛋白供应形势严峻。
目前，全国共有血液制品生产企业33家，分布在25个省、自治区、直辖市，能生产人血白蛋白、静注人免疫球蛋白、人免疫球蛋白、人乙肝免疫球蛋白、人破伤风免疫球蛋白、人狂犬病免疫球蛋白、人凝血酶、人纤维蛋白止血胶等十余种血液制品。现有的血液制品生产企业血浆蛋白分离设计能力达到12000吨原料血浆。
虽然国内血液制品短缺，但我国对人血白蛋白和其他血液制品的进口并未解禁。据颜江瑛介绍，1981年在美国发现第一例艾滋病人以后，各国对血液制品的进出口管理都加大了监管力度。我国卫生部1984年颁布相关文件限制血液制品的进口，1986年禁止了血液制品的进口。现在，我国仍然没有解除对进口血液制品的限制，主要是从安全角度考虑。另外，我国现有的血液制品生产企业，如果原料血浆充足，是能够满足血液制品临床需求的。
【摘要】 目的：观察鱼类血红蛋白与人血红蛋白及其相互之间的相互作用。方法：利用淀粉－琼脂糖混合凝胶交叉电泳的方法。结果：人血红蛋白穿过或兜过四种鱼类血红蛋白时并没有出现通常相互作用（简称互作）所观察到的“峰”或“谷”的改变。结论：鱼类血红蛋白与人血红蛋白之间没有互作，这一结果对了解血红蛋白的四级结构及分子进化都具有一定的意义。
【关键词】 鱼类；血红蛋白；相互作用；进化
Abstract Objective:To observe the interaction of fish Hb on human Hb. Methods: Agarose-starch mixed gel electrophoresis was used. Results:There was no "peak-like" or "valley-like" changes appearing while four different kinds of fish Hbs crossing human Hb. Conclusion: No interaction between fish and human Hbs. This will significantly contribute to understanding quarternary structure and molecular evolution of hemoglobin.
Key words Fish; Hemoglobin; Interaction; Evolution
以前，我们利用交叉电泳证明，在红细胞外，人血红蛋白A2与血红蛋白A可以发生相互作用［1］。后来推测，这种相互作用可能是各种血红蛋白之间的普遍规律。目前通过实验已经证实哺乳类中的家兔、大小鼠以及几种鸟类的血红蛋白均可同人血红蛋白发生相互作用［2－5］。为了进一步检验这种设想是否正确，我们选择市场上常见的四种鱼类：鲤鱼、鲫鱼、金鱼和泥蚯，用它们的红细胞制备溶血液，然后与人的红细胞溶血液进行交叉电泳实验，观察它们之间是否发生相互作用。
1 材料与方法
1.1 材料硼酸缓冲液（pH9.0），1×TEB缓冲液（pH8.6），氨基黑10B染色液，5%冰醋酸溶液。正常成人血样来自附属医院血库，各种鱼类血样来自水产品市场。
1.2 方法
1.2.1 新鲜鱼抗凝血的采集 采用心脏穿刺取血[1]，肝素抗凝。
1.2.2 溶血液制备 取人或鱼的抗凝血，离心除去血浆，然后用0.9%生理盐水（泥蚯用0.7%生理盐水）洗涤红细胞3～4次，最后向红细胞层加入1～1.5倍体积蒸馏水及0.5倍体积四氯化碳，激烈振荡后离心，取上层红色溶血液备用。
1.2.3 电泳分析 利用我室传统的淀粉-琼脂糖混合凝胶电泳。加样方法根据需要分为两种：单排加样，即在板的一端距边缘1.5～2cm处或中央并排加样，使加样线处于同一水平。双排加样，适用于快泳血红蛋白与相对慢泳血红蛋白之间的相互作用，具体又分为：穿过实验：前排（阳极侧）为一条长加样线，加慢泳血红蛋白，后排（阴极侧）为一短加样线，加快泳血红蛋白，相互拉开一定距离并在两边配上不交叉对照样品;兜过实验：前排（阳极侧）为一条短加样线，加慢泳血红蛋白，后排（阴极侧）为一长加样线，加快泳血红蛋白，相互拉开一定距离，并在两边配上不交叉对照样品。
1.2.4 染色方法及电泳结果的保存 将电泳完毕的胶板置于氨基黑10B染色液中染色1h后转入5％的冰醋酸中反复漂洗，直至胶板底色清亮透明，然后取出，观察结果、拍照、阴干保存。
2 结果
2.1 人血红蛋白与四种鱼类，即鲫鱼(Crucian carp)、鲤鱼(Common carp)、泥蚯(Loach)及金鱼(Goodfish)血红蛋白电泳位置的相对比较。使用淀粉-琼脂糖混合凝胶电泳，采用单排加样法，加样线位于板中央，样品均为溶血液，电压为6～8V/cm，电泳约3～4h，电泳结果见图1。
图1 人血红蛋白与四种鱼类血红蛋白电泳位置的相对比较 （略）
由此图可以看到鱼类血红蛋白与人血红蛋白相比具有如下特点：（1）四种鱼的血红蛋白组分及电泳行为各不相同，鲤鱼具有三种主要的血红蛋白组分，由阳极侧向阴极侧分别命名为HbCⅠ、HbCⅡ及HbCⅢ。泥蚯有两种主要的血红蛋白组分，它们对称地分别于加样线的阴阳极两侧，分别命名为HbP(Positive)和HbN(Nagative)。金鱼和鲫鱼均只有一个主要的血红蛋白组分。（2）四种鱼的血红蛋白与人血红蛋白A相比均为相对慢泳血红蛋白，电泳速度比较为：人HbA>泥蚯HbP >金鱼Hb>鲫鱼Hb=鲤鱼HbCⅠ>鲤鱼HbCⅡ>鲤鱼HbCⅢ>泥蚯HbN。根据上述特点我们便可以选用适当的交叉电泳方法来分析各种血红蛋白间的相互作用。
2.2 鱼类血红蛋白与人血红蛋白之间的相互作用
2.2.1 鲤鱼血红蛋白与人血红蛋白之间的相互作用 分别采用双排穿过和兜过实验，让快泳人血红蛋白穿过或兜过相对慢泳鲤鱼血红蛋白。电压为6～8V/cm通电约5h左右，结果见图2。
图2 鲤鱼血红蛋白与人血红蛋白之间的相互作用（略）
由上述两图可见，人血红蛋白A在穿过和兜过鲤鱼血红蛋白后，区带位置及形状均未发生变化，说明两者之间可能没有发生相互作用。
2.2.2 泥蚯血红蛋白与人血红蛋白之间的相互作用 分别采用双排穿过和兜过实验，加样线位于板中央，让快泳人血红蛋白穿过或兜过相对慢泳泥鳅血红蛋白。电压为6～8V/cm通电约5h左右，结果见图3。
图3 泥蚯血红蛋白与人血红蛋白之间的相互作用（略）
可见，人血红蛋白在穿过和兜过泥蚯的两个血红蛋白组分后，二者的血红蛋白电泳区带与对照相比均未发生改变，说明两者之间可能未发生相互作用。
2.2.3 鲫鱼血红蛋白与人血红蛋白间的相互作用 分别采用双排穿过和兜过实验，让快泳人血红蛋白穿过或兜过相对慢泳鲫鱼血红蛋白。电压为6～8V/cm通电约5h左右，结果见图4。
图4 鲫鱼血红蛋白与人血红蛋白之间的相互作用（略）
由以上两图可知，人血红蛋白在穿过和兜过鲫鱼血红蛋白后，二者的血红蛋白电泳区带与对照相比均未发生改变，说明人血红蛋白与鲫鱼血红蛋白之间可能也不存在相互作用。
2.2.4 金鱼血红蛋白与人血红蛋白间的相互作用 分别采用双排穿过和兜过实验，让快泳人血红蛋白穿过或兜过相对慢泳金鱼血红蛋白，结果见图5。
图5 金鱼血红蛋白与人血红蛋白之间的相互作用（略）
由以上两图可知，人血红蛋白在穿过和兜过金鱼血红蛋白后，二者的血红蛋白电泳区带与对照相比均未发生改变，说明金鱼血红蛋白与人血红蛋白之间可能也不存在相互作用。
3 讨论
在我们以前的实验中，已经明确证明，在电场中人血红蛋白A和A2可以发生相互作用，很可能是一种“一过性对称杂交”[1]。在此基础上，我们又发现人血红蛋白与一些哺乳动物如大小鼠、家兔等血红蛋白之间也有这种相互作用[2-4]。因此，我们曾设想，这种相互作用也许是各种血红蛋白间相互作用的普遍规律。但在按照原来计划进行鱼类血红蛋白与人血红蛋白相互作用的实验时，出现了与过去设想迥然不同的情况。在完全相同的实验条件下，同时比较研究了鸟类血红蛋白或鱼类血红蛋白与人血红蛋白的相互作用。实验结果表明，鱼类血红蛋白与人血红蛋白在相互穿过时均未出现以前见到的互作所特有的“波浪形区带”，说明两者之间可能没有发生相互作用。一系列实验和多次重复的结果，都一再证明二者在相互作用方面存在明显差异[5]。此项结果不支持作者以前关于“各种血红蛋白间都可能发生相互作用，即血红蛋白互作的普遍性”的设想，从而提出不同种类动物间血红蛋白相互作用可以有差异。在这种情况下，我们有可能提出一个血红蛋白分子进化方面的新问题。
过去谈血红蛋白的分子进化，多数是讲各种血红蛋白在氨基酸序列方面的同源性。进化过程相近者，同源性较大等。这些都属于一级结构或者化学结构范畴。现在，我们是从立体结构方面，特别是从相互作用、交换二聚体、一过性对称杂交方面进行比较研究，并且发现哺乳类、鸟类血红蛋白与鱼类血红蛋白之间存在区别。
现在可以认为，在生物进化过程中，特别是脊椎动物的进化过程中，鸟类和鱼类之间在血红蛋白分子进化方面存在一定的差异。我们的研究还在进行，初步实验证明，这个差异可能还要再深入到两栖类与爬行类之间。因此，我们推断，血红蛋白的互作可能在羊膜动物和非羊膜动物之间存在分水岭，这将给血红蛋白分子进化提供新的知识。
参考文献
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一向注重身体健康的刘阿姨，年轻时很爱运动，身材很好，但随着年龄的增长，刘阿姨动得少了，人开始慢慢发福，特别是腰腹部的赘肉变多了，血脂也增高了。刘阿姨开始有意识地节食减肥，体重是降下来了，可体质也跟着降了下来。一向不爱生病的刘阿姨经常感冒，一病就是一个星期，而且非常不容易康复。最近一次查体发现，血红蛋白和血浆蛋白都偏少。
患低蛋白血症的原因
老年人控制饮食本是件好事，像张大爷那样，患了糖尿病等慢性病后进行饮食控制也是必要的，但事先一定要向医生或营养师咨询，弄清楚节食的具体尺度。做到科学合理地节制饮食，既保障机体对营养物质的需求，又不增加机体负荷。张大爷之所以会出现营养不良，就是因为饮食控制过度，很多动物性食品不敢碰。久而久之，蛋白质摄入不足，造成身体血浆蛋白水平降低。
在当今社会，由于食物短缺而导致的传统型营养不良现象已比较少见，但食物丰富后新型营养不良的现象却出现了。尤其是一些老年人，长期受心血管疾病、糖尿病、高脂血症、高血压等慢性病的困扰，又熟知其危害性，加之现在素食风潮、节食利于健康等大肆报道，以致老年人对饮食特别注意，但往往又绝对化，凡有点脂肪的食物统统不吃，反而让身体处于一种营养不良的状态，尤其是蛋白质营养不良。
老年人的身体特点也往往容易导致蛋白质缺乏。一方面，老年人的味觉变得迟钝，再好吃的东西对他们来说都味如嚼蜡，再加上不少老年人唾液分泌减少，牙齿又不好、咀嚼功能差，食欲就会大大下降，使蛋白质摄入减少。另一方面，即使吃进去了，也并不代表就能吸收。老人的胃肠功能往往不好，很多营养成分根本吸收不了。因此，这种饮食控制到了七十多岁时就不宜太严格了。八十岁以上的老人更不宜严格控制。
老人在七八十岁营养不均衡对健康的危害远比摄取含有脂肪、胆固醇的食物所产生的威胁要大，营养不良尤其蛋白质营养不良可降低身体对各种疾病的抵抗力，增加患病的危险。当然，这并不是说可以一日三餐大吃大喝，天天吃高脂肪、高胆固醇食物，而是仍要继续保持良好的饮食习惯，以保证营养均衡、身体健康。
缺乏蛋白质危害极大
我们身体里最重要的营养物质就是蛋白质，它相当于人体的建筑材料，是构成人体所有细胞的基本物质。此外，人体中最重要的活性物质如酶、激素、抗体等也都是由蛋白质组成的，所以，蛋白质是维持生命不可缺乏的营养素。可以说，没有蛋白质就没有生命。因此，一旦机体缺乏蛋白质，就会表现在各个方面。其中较常见的是：
1.免疫力下降。很容易由于细菌、病毒的感染而出现感冒、发炎。
2.老化速度加快。头发稀疏、变脆，肌肉出现萎缩，皮肤松弛、失去光泽、弹性，各个器官功能减退加快。
3.伤口不易恢复。因为蛋白质具有修补组织的功能，如果缺乏蛋白质，组织一旦受到伤害，伤口自然得不到修补，长时间不易愈合，疾病不易恢复。
4.骨质疏松。骨骼与骨骼之间的结缔组织连接紧密，有助于钙质的沉着和吸收，而结缔组织的连接紧密有赖于胶原蛋白。因为蛋白质参与胶原蛋白的合成利用，所以缺乏蛋白质结缔组织连接得就不够紧密，从而影响钙质的沉着与吸收，表现为背痛，身高下降，骨骼弱化，易发生骨折。
5.血管失去弹性，血压升高时容易破裂，出现中风。
6.便秘。肠道壁变薄，没有弹性，蠕动力不够，易引发便秘。
7.胃酸不足。胃蛋白酶无法足量分泌，而导致胃酸分泌不足，消化不良，吸收变差，从而引发肠胃问题。
合理饮食，补充蛋白质
我们每天需要的蛋白质的量是多少呢？正常人每天大约需要60克蛋白质，也就是每公斤体重大约1克左右。老年人体内合成蛋白质速度慢，而分解速度却大大加快，需要蛋白质的量比较大，每公斤体重大约为1.4克。而且各种疾病，如肾功能低下、肝功能异常，也会使老年人对蛋白质的吸收率降低。
那么，老人应怎样判断自己是否蛋白质营养不良了呢？一般来说，严格节食的老人，如果出现食欲不振，倦怠，逐渐消瘦，四肢或全身性浮肿，易感冒，反复出现各种感染，血检结果有电解质紊乱、贫血、血清胆固醇偏低或低蛋白血症等状况，就表明老人患上了营养不良症。
如果现在已经处于蛋白质缺乏的边缘，也不用太担心。可以通过饮食来增加蛋白质的摄入。食物中以肉类、乳类、蛋类、鱼虾类、豆类、坚果类含蛋白质较高，而谷类含量较少，蔬菜水果中更少。
人体对蛋白质的需要不仅取决于蛋白质的含量，而且还取决于蛋白质中所含必需氨基酸的种类及比例。由于动物蛋白质所含氨基酸的种类和比例较符合人体需要，所以动物性蛋白质比植物性蛋白质营养价值高。在植物性食物中，米、面粉所含蛋白质缺少赖氨酸，豆类蛋白质则缺少蛋氨酸和胱氨酸，两种混合食用可互相取长补短，大大提高混合蛋白质的利用率。如大米和大豆一起蒸米饭，混合食用，蛋白质的效用可大大提高。
在生活中类似的例子很多，如素什锦以豆制品、蔬菜、木耳、花生等配在一起，八宝粥以大米、小米、红豆、绿豆、栗子、花生、枣等一起煮食，都可以达到蛋白质互补作用，比单吃一种食物时蛋白质的利用率高。
动物性食品含蛋白质相对高，植物性食物中坚果类、豆类含蛋白质高。平时饮食中我们要合理搭配，荤素搭配，因为毕竟我们是吃食物，而不是只吃其中的蛋白质，吃食物就会摄入其中含有的各类营养素。比如肉类食品富含蛋白质，所提供的人体必需氨基酸比例同人体比例非常接近，吸收好，并且肉类中富含更多的矿物质和维生素，如铁、锌、B族维生素等等，对于贫血症状很有好处。但动物肉类当中脂肪和胆固醇含量较多，对于心脑血管疾病有较大的促发作用。相比动物肉类蛋白，植物类食物当中却不含有胆固醇，所含有的脂肪是不饱和脂肪，还含有膳食纤维和卵磷脂，同时，大部分植物食物中都含有异黄酮等植物化学素，有助于人体健康。因此，我们补充蛋白的时候一定要荤素搭配，全面营养。补充蛋白质的同时也要注意不要过量。首先，过多的动物蛋白质的摄入，必然同时摄入较多的动物脂肪和胆固醇；其次，蛋白质过多本身也会产生有害影响，加重肝肾代谢负担。
[关键词] 脑干出血；人血白蛋白；GSC；GOS
[中图分类号] R743.34 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2014）12（a）-0026-02
由于人体脑干属于生命中枢，是神经密集的地方，中枢神经都经此汇聚，一旦发生少量的出血状况，都将会引发严重的后果[1]。并且大部分预后很差，严重的会直接危及到患者的生命健康。脑干出血患者的症状主要表现为发病迅速，病情发展快且重，肢体麻痹，瞳孔缩小，去脑强直，出现呼吸障碍，不断呕吐，人的意识会变得模糊不清，甚至丧失意识[2]。为了探讨脑干出血的有效治疗方法，现对该院2013年6月―2014年5月间收治的脑干出血患者50例，通过给予患者药物人血白蛋白进行治疗，提高了临床疗效，又改善了患者预后，报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取在该院治疗的脑干出血患者98例，全部按照第4届脑血管病学术会议所制定出的诊断标准[3]，并经过头颅CT/MRI检查得以确诊。按格拉斯哥昏迷评分（GCS），都在在3～12分之间。按照随机原则分成实验组50例和对照组48例，实验组患者中，男性36例，女性12例，患者年龄在42～78岁之间，平均年龄为（55.3±9.2）岁，出血量在0～2 mL的共2例，3～5 mL的共18例，6～10 mL的共24例，>10 mL的共6例；观察组患者中，男性30例，女性20例，患者年龄在39～75岁之间，平均年龄为（54.5±8.6）岁，出血量在0～2 mL的共4例，3～5 mL的共9例，6～10 mL的共28例，>10 mL的共7例。
1.2 治疗方法
对于对照组的患者，按照正常治疗为主，服用常规的治疗药物，包括止血药物、抗感染药物等，并保持患者呼吸道畅通，维持电力水解处于平衡状态。对于实验组患者的治疗方法，在对照组常规的治疗之外，另外依据患者的病情，给予20%的人血白蛋白（规格为10 g/50 mL批准文号：国药准字S20023037 ），每隔12 h进行1次静脉滴注，滴注速度为1～2 mL/min，时刻观察患者病情，待有好转时，可以逐渐减少人血白蛋白的使用剂量。
1.3 观察指标
严密观测实验组和对照组两组患者的呼吸状况、血压、大脑意识、脉搏、水解电离酸碱度等状况，另外对患者进行亚低温反应测试，观察其心电图、凝血状况以及血常规等，治疗20 d之后，对两组患者的格拉斯哥昏迷评分（GCS）和格拉斯哥预后评分（GOS）进行对比。
1.4 统计方法
对所有的数据都使用SPSS19.0统计学软件进行综合分析，全部计量资料数据用均数±标准差（x±s）的形式进行表示，并用t检验，计数资料用n和百分率表示，使用χ2检验方法。
2 结果
在治疗的过程中，实验组患者的死亡率为14%（7/50），对照组患者的死亡率为12.5%（6/48），均为出血量>6 mL患者，且都在入院24 h之内。该两组患者的死亡率对比，差异无统计学意义（χ2=0.163，P>0.05）。
在对患者进行治疗之前，两组的格拉斯哥昏迷评分（GCS）分别为（5.78±1.36）分、（5.65±1.01）分，两组差异无统计学意义（P>0.05）；在治疗20 d之后，除去死亡的病实验组患者的格拉斯哥昏迷评分（GCS）为（11.31±2.12）分，明显高于对照组，该两组患者的GCS评分对比，差异有统计学意义（P
表1 治疗后实验组和对照组患者格拉斯哥昏迷评分对比[分，（x±s）]
在经过20 d治疗后，实验组患者的格拉斯哥预后评分（GOS）评分为（4.16+0.66）分，明显高于对照组患者（2.67±0.79）分，该两组患者的GOS评分对比，差异有统计学意义（t=3.115，P
3 讨论
脑干是人体最为重要的部分，神经纤维相互连结，形成网状结构，人体最为重要的中枢包括呼吸中枢、循环中枢等都汇集于此，如果脑干出血，由于常常具有突发性，出现晕倒或者昏迷状况，产生急性的颅内压迅速升高，呼吸系统出现障碍，而最终由于神经细胞受到压迫，而造成脑干功能的衰竭，患者生命就会受到严重威胁，病死率非常高[4]。该研究中，两组患者的死亡率都在10%以上，且差异无统计学意义（P>0.05），经分析发现，都是出血量在6 mL以上的患者，这也说明了脑干出血病情的凶险。由于发病的特殊性，该病症需要进行及时的内科治疗，以改善病情。
目前，人血白蛋白在治疗脑干出血等疾病方面，得到了较为广泛的应用。龙飞、Finfer S等相关研究[5-6]表明，在脑干出血中运用白蛋白具有提高血浆胶体渗透压的作用，并能有效地改善患者的血液循环，可以达到清除人体自由基的作用，对于脑干出血疾病的治疗有显著的效果。
目前，格拉斯哥昏迷评分（GCS）一直被作为鉴定脑干出血病情状况的依据，患者的出血状况与该评分呈正比例关系[7]。该研究结果显示，在治疗20 d之后，除去死亡的病例，实验组患者的格拉斯哥昏迷评分（GCS）为（11.31±2.12）分，明显高于对照组，该两组患者的GCS评分对比，差异有统计学意义（P
综上所示，对于脑干出血患者，给予药物人血白蛋白进行治疗，能够有效降低格拉斯哥昏迷评分指标，提升格拉斯哥预后评分，极大地改善了患者的预后，非常值得在临床推广和运用。
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[关键词] 人血白蛋白； 自动工艺； 铝含量
[中图分类号] R331.1+1[文献标识码] A[文章编号] 1005-0515（2011）-08-001-02
人血白蛋白是目前国际上使用广泛的血液制品，具有维持血液渗透压、抗休克、运输和解毒、营养供给等作用，主要用于烧伤、失血性休克、水肿及低蛋白血症的治疗[1]。由于Al3+可能具有引发骨软化病，低血色素性贫血，老年性痴呆和慢性肾功能损害的潜在危险性。随着血液制品临床应用研究的不断深入，人们对制血液品的安全性要求越来越高。人血白蛋白制品中Al3+含量对人体的危害成为人们关注的焦点[2]，WHO、欧洲药典(EP)及《中国药典》2000版三部对人血白蛋白制品的铝含量均有质量标准要求，即Al3+含量≤200μg/L。
我公司将国际先进的分离技术(低温乙醇自动控制生产工艺)用于人血白蛋白的规模化生产，如压滤技术，全自动控制的在线清洗消毒系统，反应条件(温度、重量、流速、PH等)自动控制系统，全自动控制大型超滤系统，全自动控制病毒灭活系统，全自动分装系统。这些自动工艺保证了白蛋白的质量，提高了收率，更好的控制了人血白蛋白Al3+含量的控制，其含量平均控制在药典标准的30%内。
1 材料与方法
1.1 材料 ①白蛋白生产的相关原、辅材料: 硅藻土(Celite公司)，进口无石棉滤板(SEITZ公司)，95%食用乙醇，注射用水和冰冻血浆(蓉生药业公司)。②人血白蛋白包装瓶：50ml白蛋白专用I型玻璃瓶(低Al2O3)由法国SGD提供。③人血白蛋白成品样品:由蓉生药业公司自动控制系统生产的2010年的连续10批样品和04年本公司的10批样品(老工艺成品)。
1.2 仪器 PE公司5100型原子吸收分光光度计，塑料管(无Al3+，取样用)。
1.3 方法
1.3.1 低温乙醇法人血白蛋白生产工艺 血浆19%乙醇沉淀FⅠ+Ⅱ+Ⅲ压滤沉淀FⅠ+Ⅱ+Ⅲ40乙醇沉淀FⅣ压滤沉淀FⅣ40乙醇沉淀FⅤ压滤沉淀FⅤFⅤ沉淀溶解纯化白蛋白超滤、脱醇、脱铝、浓缩20%人血白蛋白配制60℃、10H病毒灭活澄清除菌无菌分装孵化灯检公司检定国家批签发市场。
1.3.2 Al3+含量的测定 按照《中国药典》2000版三部附录人血白蛋白铝残留量测定法”进行。
1.3.3 统计学分析法
2 结果 通过低温乙醇法自动控制工艺生产的成品人血白蛋白Al3+含量与以前老工艺的成品人血白蛋白的Al3+含量变化，见下表1、表2。从两表比较可以看出新的自动控制工艺与以前工艺成品人血白蛋白Al3+含量平均降低10.6%，而且平均低于国家药典标准的30%。
表1自动控制工艺成品白蛋白Al3+含量
表2 老工艺的成品人血白蛋白的Al3+含量
3 讨论 据[3]研究表明，影响人血白蛋白制品中Al3+含量的主要因素有:1)用于生产中的硅藻土等助滤剂。2)含硅藻土的深层过滤的滤板。3)包装成品的内包装材料玻璃瓶。4)填充有黏土的合成橡胶瓶塞。5)生产时直接接触制品的容器。我公司在硅藻土、滤板、包装产品的玻璃瓶。橡胶瓶塞的选购上，都是选用进口低Al3+含量的材料，容器和管道都采用316L型不锈钢材质。从原辅材料方面控制了Al3+进入制品。从工艺上，我们采用国际先进的低温乙醇自动控制生产工艺，压滤技术，全自动控制的在线清洗消毒系统，反应条件(温度、重量、流速、PH等)自动控制系统，全自动控制大型超滤系统，全自动控制病毒灭活系统，全自动分装系统，全自动超滤脱铝系统，全自动病毒灭活系统对Al3+含量降低效果明显[4]。我们从原辅材料，工艺流程各个环节更好的控制了人血白蛋白Al3+含量的控制，其含量平均控制在药典标准的30%内。尽管低温乙醇血浆蛋白分离工艺已延用多年，但由于自动化程度不高，大部分工序均为人工操作，众多技术指标均靠经验和手工控制，如乙醇、缓冲液的滴加，设备的清洗，制品反应温度的控制和反应液计量等，且不说工作人员劳动强度大，操作时人为的因素造成的误差(操作误差、计量误差、温度控制误差等)严重影响着制品的质量和收获率，形成较大的批间差，未能充分发挥低温乙醇血浆蛋白分离的诸多优势[5]，通过实现低温乙醇法自动化控温、称重、加液和自动清洗，从而实现了设备状态的自动控制，减少了血浆蛋白分离过程中手工操作的误差，有效地控制了制品制备过程中的微生物污染，降低热原质。通过自动化控制，使得血浆蛋白分离过程中严格控制的五个控制因素(反应液温度、乙醇浓度、离子强度、pH值和蛋白浓度)有机结合并得到准确的控制，使得整个血浆蛋白分离过程趋于理想状态，使被分离的制品各项质量指标更加趋于稳定[6]，工艺特点得以最大限度的发挥，更加符合GMP管理要求，不但降低铝含量而且提高了白蛋白的收率，从而获得较好的社会效益和经济效益。
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[摘 要] 目的:观察拔罐疗法对人体局部血红蛋白的改变及变化规律。
方法:采用现代物理学的光谱技术,以人体皮肤局部血红蛋白变化作为定性和定量指标。
结果:拔罐能够使局部组织的血氧状态发生改变,主要是氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的明显增加,并呈现动态变化,即上升到一定高度后较平稳地维持,启罐后有所下降,但仍然维持在一定高度的曲线变化。并且,氧合血红蛋白及脱氧血红蛋白二者关系密切,氧合血红蛋白增加量大大高于脱氧血红蛋白。
结论:拔罐使局部组织处于高供氧低消耗状态,其对局部组织的作用是良性的,极其有利于新陈代谢的改善。
[主题词] 拔罐;血红蛋白/分析;氧合血红蛋白/代谢EffectofCuppingTherapyonLocalHemoglobininHumanBodyZhangLi1,TangLitin
g1,TongXiaolin2,etal(1.DepartmentofAcupMoxibustionandMassage,BeijingUniversityofTCM,Beijing100029;2.ChinaJapanFriendshipHospital)[Abstract] Purpose Toobservechangeregularpatternoflocalhemoglobinofhumanbodyincuppingtreatm
ent.Methods Spectraltechniquewasadoptedandchangesofhumanlocalskinhemoglobinwer
eusedasqualitativeandquantitativeindexes.Results Cuppingcouldchangestateofbloodoxygenoflocaltissue,manifestingasobvious
increaseofoxyhemoglobinanddeoxyhemoglobinwithdynamicchange,thatis,itkeptsteadyatthelevel
whenitwasincreasedtoacertainheight,anditwasreducedbysomewhatandkeptt
hecurvechangesatacertainheightafterthecupwasremovedout.Therewascloselyrelationbe
tweenoxyhemoglobinanddeoxyhemoglobin,andtheincreaseofoxyhemoglobinwasmuchhig
herthanthatofdeoxyhemoglobin.Conclusion Cuppingcanmakelocaltissueatastateofhighsupplyandlowerconsumptionofoxygenwhichisbeneficialtoimprovementofmetabolism.
[Keywords] CuppingTherapy;Hemoglobins/anal;Oxyhemoglobins/metab
拔罐疗法是指用加热、抽气等方法使杯、筒、罐内气压低于普通大气压,并使其吸附于体表病痛部位或穴位以治疗疾病的方法。对其机理的研究,近年来已引起医学界的关注。本研究观察拔罐对局部血红蛋白改变情况和变化规律,分析这一过程和规律的现象及本质,探讨拔罐疗法的作用机理,为临床应用拔罐疗法防病治病保健提供可靠的实验依据。
1 材料和方法
11 一般资料纳入标准①正常健康成年人。②标准体重或体重指数(BMI>30)正常。本组21人,其中男10人,女11人;年龄21～30岁3人,31～40岁5人,41～50岁4人,51～60岁4人,61岁以上5人;体重51～60kg5人,61～70kg7人,71kg以上9人。
12 主要仪器①玻璃火罐(Ⅱ号,容积为80ml),②近红外血氧检测仪(Japanshimadzuom-100型)。
13 条件控制保持室内外通风隔绝。保持室内无阳光直射,无强红外辐射源存在,室内温度在22±1℃,湿度在40%左右。受试者被测部位预先充分暴露于室内20分钟。受试者在安静放松状态下,俯卧进行测试。拔罐的压力控制值45±5kPa。
14 部位选择选择右侧肩胛骨内侧缘垂线,做一条水平于第11胸椎棘突的连线,该连线的1/2(相当于脾俞穴)处拔罐。
15 操作步骤将近红外血氧检测仪的发射光源及吸收光源的探头固定于拔罐部位,启动自动描记图象装置开始描记变化曲线,描记一段基线后,将火罐叩罩在待测部位上。在拔罐过程中和启罐后的时间(不少于40分钟)内,连续观测液晶屏幕上曲线图象及数值变化,并用计算机同步记录局部组织氧合血红蛋白以及脱氧血红蛋白的相对变化量的数据。所测定的局部组织血氧状态的相对定量值,按时段读取,进行对比分析,做统计学处理。
2 结果
拔罐开始记录位于零位,氧合血红蛋白含量在拔罐开始较短的时间内迅速升高,5分钟左右升幅变缓;启罐后稍有降低,并基本维持一定的水平。脱氧血红蛋白图形变化趋势基本和氧合血红蛋白相同,脱氧血红蛋白升幅较小。数值:数值变化和曲线变化相应。
根据拔罐时血红蛋白曲线变化规律,用同体比较t检验的方法,按照有无统计意义将曲线变化值划分为:初始(0)、拔罐(迅速升高A段,缓慢升高B段,平缓变化C段)、启罐(迅速升高D段,平缓变化E段)三部分,进行观察和比较。
21 各段氧合血红蛋白的含量变化(见表1)。
表1 受试者氧合血红蛋白含量变化比较(n=21)
表1中可以看出:拔罐初始点0与各段曲线均值差异有极显著意义;拔罐1分钟时与拔罐以及启罐后的各段曲线比较,差异都有极显著的意义(P
22 各段脱氧血红蛋白的含量变化(见表2)。
表2 受试者脱氧血红蛋白含量变化比较(n=21)
表2中可以看出:拔罐初始点0与各段曲线均值比较有非常显著或极显著的统计学意义(P
23 氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的曲线对应段进行相关比较(表3)。
表3 氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白相关比较(n=21)
从表3可以看出:通过氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白相关比较,可知两者相关系数有非常显著的意义,氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白变化呈正相关,关系非常密切。
3 讨论
拔罐疗法历史悠久,数千年来不断发展。由于其使用方法简便安全,疗效显著,副作用少,故临床应用十分普遍。中医学认为其主要有平调阴阳、扶正祛邪、疏通经络、活血止痛、调和脏腑、托毒排脓等作用[1];西医学认为其主要有调整神经系统、改善微循环、促进新陈代谢、提高免疫力、缓解疼痛、修复损伤、改善皮肤生理功能等作用[2,3]。在光谱中,波长为700～1200的近红外光具有较高的人体穿透能,通过这种光线,可以无创伤地测定人体机能变化[4]。存在于红细胞中的血红蛋白即氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白,二者有不同的吸光度,分别在760nm和850nm近红外区形成两个吸光高峰,其变化情况反映了血红蛋白带氧情况。据此建立起的近红外光谱诊断技术称为NIRS[5]。NIRS技术在1991年以后主要应用于新生儿脑氧代谢状况的测定、胎儿脑氧代谢的监测、新生儿期心脏外科手术监护等方面[6],在脑血液动力学研究、缺氧缺血时脑细胞代谢研究、脑功能状态研究[5]等领域中独具特色。另外,NIRS也有用于肝移植后无创伤地监测肝血流量的变化[6]、肌肉氧代谢检测、运动医学疾病及末梢动脉疾病诊断方面应用的报告[7～10]。在实验方面,NIRS可以用于一些急性动物实验及慢性实验过程中的一些急性反应,无创或部分有创地进行组织血氧变化的测定[5]。当近红外技术在医学中的应用越来越受到重视的今天,采用NIRS技术对用拔罐疗法时进行局部组织血氧状况进行测定,是在新领域中应用该项技术的一种探索。
血红蛋白是人体红细胞主要蛋白质,有着重要的生理功能。它是一种双向呼吸载体,可以将氧气运输到身体各个组织,再将代谢最终产物二氧化碳输出体外,是影响体内某部分(组织器官)单位时间内氧耗量和代谢率的直接因素。氧合血红蛋白含量高,供氧好;脱氧血红蛋白含量低,表明消耗低。
应用NIRS技术测定拔罐疗法对局部组织血红蛋白的影响,结果表明,拔罐能够改变局部组织血红蛋白的含量,主要是氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白明显增加。其增加的特征呈动态变化:拔罐开始氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白含量迅速增加,增加到一定高度后较平稳,启罐后有所下降但仍保持一定高度并持续一定时间。根据NIRS原理,血红蛋白变化量的增加反映了该时间内动脉血液流入量的增加。
氧合血红蛋白含量升高,脱氧血红蛋白含量升高幅度大大低于氧合血红蛋白的升高幅度,说明拔罐时局部血氧供给好,消耗(如肌肉的收缩运动等)相对低,进一步说明拔罐使局部组织处于高供氧低消耗状态,其作用是良性的,有利于新陈代谢的改善。
本研究说明:拔罐过程中及启罐后温度及血红蛋白含量升高状态的形成、维持的客观变化过程和规律,在客观上说明拔罐疗法对皮肤局部组织的影响是一个动态变化过程;是使局部组织处于高供氧低消耗状态的过程。中医的拔罐疗法作用是良性的,不仅是在拔罐时,而且在启罐后仍持续发挥作用。由此使得拔罐疗法具有了独特的疗效。
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摘要： 目的 建立一种灵敏易行分离分子量＜10 000 Da低丰度蛋白质的电泳方法。方法 用Hitrap Blue层析柱去除血清中白蛋白，用U9对血清样品进行变性处理，采用改进后的方法(01%甲醇，05%三氯乙酸，01%考马斯亮蓝G250)进行染色。结果 经去除血清中的白蛋白、对样品进行变性处理及改进染色方法后，分辨率和灵敏度明显提高，可有效分离10 000 Da以下的小分子蛋白质。结论 改进后的电泳方法，不仅简便灵敏，而且还有利于蛋白质的洗脱回收。
关键词： 聚丙烯酰胺凝胶电泳；蛋白质；分离
Separation of micro molecular protein in human serum with improved Tricine-SDS-PAGE system
Gangxi Center For Disease Control and Prevention(Nanning 530021,China)Abstract： Objective To separate less abundant proteins less than 10 000 Da with an effective Tricine-SDS-PAGE system.Methods The human serum albumin was removed by Hitrap Blue column,and serum was dealed with U9.Then gel was stained by the improved method(01% carbinol,05% TCA,01%Coomassie briliant blue G250).Results The discovery and detection of less abundant proteins less that 10 000 Da were improved obviously by removal of human serum albumin,serum treated with U9 and improvement of staining.Conclusion The improved Tricine-SDS-PAGE system is not only effective to resolve these less abundant proteins less than 10 000 Da,but also favourable to recover these proteins from gel.
Key words： SDS-PAGE;protein;separation
患者血清中某些小分子蛋白标志物可以用于疾病监测和快速诊断，但分离分子量＜10000Da的小分子蛋白质面临很多问题。三(羟甲基)甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳(TricineSDSPAGE)是目前一种有效分离小分子蛋白、多肽的电泳方法，可以用于分离小至1kDa的小分子肽〔1〕。但其分离效果与样品处理、样品中目的蛋白含量以及染色方法等密切相关。文献报道，使用TricineSDSPAGE分离小分子蛋白的样品多为蛋白质标准品〔1-3〕。作者在分离小分子肽的实验中发现，根据文献报道的方法，对于分离蛋白标准品或高丰度蛋白效果尚可，但直接用于分离人血清中低丰度的小分子蛋白效果并不理想。因此，作者在样品的处理、染色等方面进行改进，建立了一种效果理想、简便灵敏的分离人血清中小分子蛋白质的方法。结果报告如下。
1 材料与方法
11 材料
111 试剂与仪器 磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、尿素、丙烯酰铵、N，N′-甲叉双丙烯酰铵、过硫酸铵、盐酸、氢氧化钠、甘油、溴酚蓝、三氯乙酸(TCA)、甲醇、戊二醛、醋酸、考马斯亮蓝G250、低分子量蛋白质标准品、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、三羟甲基甲基甘氨酸(Tricine)、二硫苏糖醇(DTT)、3-［(3-胆酰胺丙基)-二乙胺］-丙磺酸(CHAPS)、十二烷基硫酸钠(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)(上海生工生物工程有限责任公司)；AKTA Purifier-900层析系统、Hitrap Blue层析柱(美国Amersham Biosciences公司)；Power Pac HCTW电泳仪、Mini Protean 3well垂直电泳槽(美国Bio-Rad公司)；摇床(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。
112 样品 样品取自广西医科大学第一附属医院经病理诊断的肝细胞癌患者血清。
12 方法
121 溶液配制 (1)层析缓冲液配制：结合缓冲液为390ml的20mmol NaH2PO4和610ml的20mmol Na2HPO4溶液混合成1000ml的磷酸盐缓冲液，用HCl调pH值至70。用配制好的结合缓冲液配500ml的2mol NaCl磷酸盐洗脱缓冲液。(2)凝胶贮存液配制：A贮液为495%丙烯酰铵总浓度，3%交联度的丙烯酰铵贮存液：称取48g丙烯酰铵和15g N，N′-甲叉双丙烯酰铵，溶于100ml双蒸水，溶液混匀后经滤纸过滤。B贮液为495%丙烯酰铵总浓度，6%交联度的丙烯酰铵贮存液：称取465g丙烯酰铵和3g N，N′-甲叉双丙烯酰铵溶于100ml双蒸水，溶液混匀后经滤纸过滤。胶缓冲液为3mol Tris，03g/L SDS用HCl调pH值至845。(3)蛋白质电泳溶液配制：阳极缓冲液为02 mol Tris,用HCl调pH值至89，阴极缓冲液为01mol Tris，01mol Tricine，03g/L SDS用HCl调pH值至825。(4)样品缓冲液配制：3mol Tris(pH 845)，24 ml甘油，08g SDS,03mol DTT，少许溴酚蓝，定容至10ml。
122 层析柱去除白蛋白 冻融血清，4℃，12000r/min，离心5min，取上清液1ml，用9ml结合缓冲液按1∶9比例稀释上样于Hitrap Blue层析注，在AKTA Purifier900层析系统上进行层析分离，用磷酸盐洗脱缓冲液以流速2ml/min进行洗脱。在层析过程中，AKTA Purifier900层析系统自动收集未与层析柱结合部分的溶液和洗脱液(1ml/管)，并绘出280nm波长处的吸光度(A280nm)曲线。
123 胶的制备 按文献〔2〕分别配制分离胶、间隙胶和浓缩胶，依次灌胶。
124 样品处理 将样品1(未与层析柱结合部分的溶液)和样品2(洗脱液)，分别倒入3000Da的超滤离心管，4℃，12000r/min，离心浓缩2h，浓缩体积至1ml。分别加入到含2ml U9缓冲液(9mol Urea,2%CHAPS,1%DTT)的离心管，400～600r/min冰浴振荡30min。取样品1、2分别与样品缓冲液等体积混匀，60℃水浴加热5min。
125 电泳条件 内槽装阴极缓冲液，外槽用阳极缓冲液恒压电泳，先40 V约15 h，当样品进入分离胶时，电压升至60V约15h。
126 染色和脱色 电泳结束时，用双蒸水把胶面洗净。分别采用方法1：置于新鲜配制的5%戊二醛溶液中固定，50～60r/min，振荡1h。然后用双蒸水洗净胶面，用含0025%考马斯亮蓝G250的10%醋酸溶液染色，50～60r/min，振荡1h，最后转至10%醋酸溶液脱色，直到背景清晰。方法2：置于染色液(01%甲醇，05%TCA，01%考马斯亮蓝G250)中，50～60r/min，振荡染色1h。然后用双蒸水洗净胶面，转至双蒸水脱色，1h。更换双蒸水2～3次，直到背景清晰。
2 结果
21 层析柱去除血清白蛋白前后的比较(图1，图2) 血清经Hitrap Blue层析柱分离后，得到2个吸收峰，分别命名为组分Ⅰ、组分Ⅱ。组分Ⅰ为未与层析柱结合的蛋白质，组分Ⅱ为白蛋白洗脱液。组分Ⅰ、Ⅱ与血清原样的电泳结果比较显示，血清原样白蛋白污染严重，组分Ⅰ经去除白蛋白后，白蛋白污染显著减少，电泳可分离出10000Da以下的小分子蛋白质。
图1 经Hitrap Blue层析柱分离的各组分（略）
A：低分子量蛋白质标准品；B：血清原样；C：组分Ⅰ；D：组分Ⅱ
图2 不同组分电泳结果比较（略）
22 样品用U9处理前后比较(图3) 组分Ⅰ用U9处理前后的凝胶图显示，未用U9处理的样品，分离10000Da以下的小分子蛋白效果不佳；用U9处理后的样品，10000Da以下的小分子蛋白清晰可见。
23 不同染色方法比较(图4) 相同样本凝胶分别用方法1和方法2进行考马斯亮蓝染色。结果显示，用方法1染色，凝胶背景颜色深，分离10000Da以下的小分子蛋白效果不佳；用方法2染色，凝胶背景颜色浅，10000Da以下的小分子蛋白清晰可见。
3 讨论
本实验采用的TricineSDSPAGE方法与目前国内外采用的相似，可有效分离小分子蛋白和多肽〔1-3〕。但用此法直接分离未经任何处理的人血清时效果不佳，可能与血清中小分子目的蛋白的含量太低有关。利用Hitrap Blue层析柱去除白蛋白后，不仅可以增加电泳样品的上样量，还可分辨出10000Da以下的小分子蛋白质或多肽。本实验还发现，样品经含尿素、CHAPS和DTT的U9处理后，有助于分离小分子蛋白。U9可以断裂蛋白质间的氢键和二硫键，使疏水相互作用被取消，多肽被去折叠，从而提高电泳中蛋白的分辨率〔5，6〕。此外，快速的固定、染色和脱色对于提高小分子多肽电泳的分辨率也是必要的，这主要是由于小分子多肽对染料的结合力较弱，易扩散冲洗掉而着色较差〔2〕。传统的染色方法多采用甲醛、甲醇〔7〕、戊二醛〔8〕、乙酸和乙醇〔9〕等进行固定、染色和脱色，但小分子多肽有时很难被固定，且染色背景较深，脱色时间长，大大降低了分辨率和灵敏度。本实验应用经过改良的染色液配方，用＜1%浓度的三氯乙酸代替高浓度的乙酸，甲醇浓度也只有01%，染色和脱色时间相对较短，使染色液检测灵敏度提高，可以检测10ng/条带的蛋白质。而且染色过程中由于背景颜色很浅，可以随时看到染色的进度。脱色过程简便易行，只需用水，不需要用缓冲液反复冲洗脱色。但如果用水冲洗，能得到透明无色背景，可以进一步提高检测灵敏度。
A：低分子量蛋白质标准品；B：用U9处理后的样品；C：未用U9处理样品
图3 样品用U9处理前后的比较（略）
A：低分子量蛋白质标准品；B：方法1；C：方法2
图4 不同染色方法的比较（略）
参考文献
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【摘要】 目的以光谱技术研究表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和吐温-80(TW-80)对中药有效成分黄芩苷与人血清白蛋白(HSA)的相互作用机制的影响。方法用荧光光谱及紫外光谱技术。结果表面活性剂存在时静态猝灭和非辐射能量转移仍是黄芩苷猝灭HSA内源性荧光的主要原因;CTAB和TW-80存在时，结合常数明显降低，SDS存在时结合常数增加。结论表面活性剂的存在没有改变黄芩苷对HSA内源性荧光猝灭的机理，但使黄芩苷与HSA间的主要作用力由静电作用转化为疏水作用。
【关键词】 黄芩苷; 人血清白蛋白; 表面活性剂
血液是一多组分复杂系统，来源于药物制剂中的其它成分必然对药物与血清白蛋白的结合产生某种扰动作用，进而影响药物的分布、转运和贮存形态甚至药物的药效。一些表面活性剂如十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate，SDS)、吐温-80(TW-80)等常被用作乳化剂、润湿剂、增溶剂或分散剂等加入药物制剂。因此，研究表面活性剂对药物与蛋白质分子相互作用的影响很有意义。
中药有效成分黄芩苷分子结构如图1 所示，属于黄酮类化合物，存在于多种植物中，具有抗氧化[1]、预防缺血性脑中风[2]、解热[3]等药理作用。本文运用荧光光谱、紫外光谱等技术，研究了表面活性剂的存在对黄芩苷与HSA相互作用的影响。这对阐明黄芩苷制品在体内的输送和代谢过程具有重要的意义。图1 黄芩苷的分子结构
1 仪器和试剂
RF-5301PC型荧光光度计(日本岛津公司);UV-2450PC紫外可见分光光度计(日本岛津公司);人血清白蛋白(HSA，德国Merck公司)，用pH7.40的Tris-HCl缓冲溶液(含0.1 mol·L-1NaCl)配制，其储备液浓度为1.5×10-5mol·L-1，4℃保存;黄芩苷(中国药品生物制品检定所)，储备液(1.0×10-3 mol·L-1)用无水甲醇配制;其他试剂均为分析纯，实验用水均为二次去离子水。
2 方法
在3ml含有1.0×10-5mol·L-1HSA溶液的比色皿中，以微量注射器逐次加入不同体积的黄芩苷储备液(累加体积
以Tris-HCl缓冲溶液为溶剂，配制1.0×10-5mol·L-1的黄芩苷溶液，实验温度下恒温测定其300～500 nm的紫外可见吸收光谱。
2 结果
2.1 无表面活性剂时黄芩苷与HSA的相互作用
2.1.1 荧光猝灭机理用黄芩苷滴定HSA溶液的过程中，HSA的荧光被猝灭(如图2)，说明二者发生了相互作用。由图2可见HSA在337 nm处荧光强度随药物浓度增加而逐渐减小，若将此猝灭归因于分子碰撞引起的动态猝灭，则依照Stern-Volmer方程和Ksv=kqT0(kq是双分子动态猝灭速率常数;T0是生物大分子内源性荧光寿命，本文取T0=10-8s[4])得Kq值为1013量级，远大于猝灭剂对生物大分子的最大动态猝灭速率常数(2.0×1010L·mol-1·s-1)，故黄芩苷对HSA荧光的猝灭过程主要为静态猝灭过程[5]。图3中黄芩苷的紫外吸收光谱与HSA的荧光发射光谱有相当程度的重叠现象，据Fφrster无辐射能量转移理论[6]，黄芩苷与HSA之间存在着非辐射能量转移，因此可以判断非辐射能量转移与静态猝灭一样也是导致黄芩苷对HSA荧光猝灭的原因之一。CHSA:1.0×10-6mol·L-1;Cbaicalin /10-6mol·L-1，从上至下: 0， 0.5， 1.0， ， 2.0， 3.0， 4.0， 5.0，6.0，7.0图2 黄芩苷与HSA相互作用的荧光猝灭图图3 黄芩苷紫外吸收光谱与HSA荧光发射光谱重叠图
2.1.2 黄芩苷与HSA的结合常数及结合力类型药物与血浆蛋白的结合是决定药物分布和作用的一个重要因素。根据公式：lg(F0-F)/F =lgKA+nlg[Q]以lg(F0-F)/F 对lg[Q]作图，可得结合常数KA的值(见表1)，反应的结合常数可达105，说明黄芩苷与HAS有较强的结合，可生成黄芩苷-HSA复合物;人血清白蛋白在体内能起到储存和运输药物的作用，使药物通过血液循环达到作用部位，起到治疗的效果。
为进一步确定黄芩苷与HSA结合的作用力类型，根据van′t Hoff方程求得了热力学参数(见表1)。由ΔG0，可知这是一个熵增加、Gibbs自由能降低的自发过程。Ross等[7]认为，ΔS>0是疏水作用的重要特征，而在水溶液中，静电作用过程也表现为ΔS>0，ΔH
2.2 表面活性剂存在时黄芩苷与HSA的相互作用分别配制含有一定浓度阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)、阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和非离子表面活性剂吐温-80(TW-80)的HSA标准溶液，其他条件同上，进行实验。3种表面活性剂参与时黄芩苷对HSA的荧光猝灭结果见图4。实验数据按照Stern-Volmer方程处理的结果，由Fφrster无辐射能量转移理论计算得到的r，结合常数KA，有关作用过程的热力学参数计算值一并列于表2。CHSA:1.0×10-6mol·L-1; Cbaicalin/CHSA=1∶11.HSA 2.HSA+SDS 3.HSA+TW-80 4.HSA+CTAB图4 表面活性剂CTAB、SDS和TW-80存在时黄芩苷与HSA相互作用的荧光光谱1.baicalin;2.(1)+TW-80; 3.(1)+SDS; 4.(1)+CTAB图5 表面活性剂与与黄芩苷作用的紫外吸收光谱图
表2 表面活性剂参与时黄芩苷-HSA结合的实验结果
由图4可见，表面活性剂存在时黄芩苷对HSA仍具有猝灭作用，表明黄芩苷与HSA之间仍存在相互作用。综合表2中结果可以推断：表面活性剂存在时，黄芩苷对HSA荧光的猝灭机理没有发生改变，静态猝灭和非辐射能量转移仍是两大成因。但表面活性剂的存在影响了黄芩苷与HSA的结合：当CTAB和TW-80存在时，结合常数明显降低，说明阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂的参与增加了药物分子的游离浓度，有利于药物快速释放，发挥药效;而当SDS存在时结合常数增加，表明阴离子表面活性剂的参与降低了药物分子的游离浓度，有助于药物持久缓释发挥药效。由热力学函数计算知表面活性剂存在时，黄芩苷与HSA的作用过程仍是一个熵增加、Gibbs自由能降低的自发作用过程，但ΔS>0、ΔH>0表明黄芩苷与HSA间作用力由静电作用为主转变为以疏水作用力为主。
导致这种结果可能存在以下原因：表面活性剂对蛋白质分子构象的改变和表面活性剂对药物分子的影响。一方面表面活性剂与HSA之间能够相互结合，会导致HSA分子构象发生转变，必然会影响药物-HSA的结合。表面活性剂CTAB和TW-80存在时，改变了蛋白质构象，使蛋白质亲水区色氨酸残基的微环境发生改变，从而色氨酸残基微环境的极性降低，蛋白质扩展，疏水性增强，破坏了静电作用力，使黄芩苷与HSA的相互作用以疏水作用力为主，导致二者的结合减弱，即结合常数减小;当SDS存在时，同样可使色氨酸残基微环境的极性降低，然而结合增强，可能是疏水作用力和静电作用力正协同效应作用的结果[8]。另一方面表面活性剂与药物分子存在一定的相互作用，如图5所示CTAB、SDS和TW-80存在时，黄芩苷的紫外最大吸收峰位置没有明显变化，但最大吸光度有所降低，表明CTAB、SDS和TW-80与黄芩苷也存在一定程度的结合，可能形成了复合物。这种结合势必也会影响黄芩苷与HSA的结合。因此，表面活性剂与黄芩苷的结合及表面活性剂对蛋白质分子构象的破坏影响了黄芩苷与HSA的相互作用。
此外表面活性剂与药物对HSA同一结合位点可能存在的竞争性结合及表面活性剂对药物在蛋白上结合部位的破坏也可能是影响药物与HSA结合的原因[8]。
3 结论
本实验研究结果表明，表面活性剂CTAB、SDS和TW-80的存在没有改变黄芩苷对HSA内源性荧光的猝灭作用，静态猝灭和非辐射能量转移仍然是猝灭形成的两大原因;但表面活性剂的存在影响了黄芩苷-HSA复合物的稳定性，改变了主要结合力的类型，使静电作用力为主转变为疏水作用力为主。这些结果为了解黄芩苷制剂在体内的运输和分布，阐明其作用机制等提供理论依据。
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