白术、苍术种子位点特异性PCR鉴别方法研究

[摘要] 目的：筛选白术、苍术鉴别SNP位点，并设计特异性引物，实现白术、苍术种子的快速鉴定。方法：通过测序及GenBank中下载获得白术、苍术的 psb A-trn H序列，通过使用Bioedit软件比对获得SNP位点，设计位点特异性PCR引物，将ITS通用引物加入到特异性引物构建多重PCR体系，并优化PCR条件，对白术、苍术种子进行分子鉴定。结果：构建了多重PCR鉴别体系，通过一个PCR反应，能扩增出苍术、白术约643 bp 的ITS DNA质控条带，扩增出白术172 bp的特异性鉴别条带，实现白术、苍术鉴别。结论：使用位点特异性PCR技术可以有效鉴别白术、苍术种子。

[关键词] 白术；SNP；分子鉴定；种子

[收稿日期] 2013-02-28

[基金项目] 北京市科技专项“道地中药功能基因组北京市重点实验室2012年阶梯计划项目”

[通信作者] *袁媛，E-mail： 中药材白术是菊科Compositae植物 Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎，多为栽培品，主要产于浙江、安徽、湖北、湖南、江西等省。种子繁殖是白术传统的生产方法，但目前许多药材种子都是自留种或从药材市场购买，种子缺少足够的检测检验标准和合格包装[1]，存在不少陈旧种子、不完全成熟种子或伪品[2-3]，如何科学鉴定中药材种子，建立中药材种子标准意义重大[4]。

白术与其近缘种苍术种子形态上很相似，在实际生产和种子销售中容易混杂。苍术来源植物为茅苍术 A. lancea 或北苍术 A. chinensis ，据2010 年版《中国药典》记载，白术和苍术在功效上存在显著差异[5]，因此如何准确鉴别2种药材的种子，保证白术种质来源、避免种源混杂，对保障白术药材质量以及安全用药具有重要意义。

关于白术与苍术的鉴定研究已有报道[6-7]，但对于其种子的来源鉴别研究鲜有报道。近年来，以分子生物学为基础的检测方法被应用于药材鉴别中，特别是位点特异性PCR可用于检测单个或多个位点的核苷酸变异，即可通过单个PCR反应区分药材的真伪品，已成功用于藁本[8]、石斛[9]、金银花[10]等中药材的真伪品鉴别。本文通过使用位点特异性PCR技术，利用白术与苍术的SNP位点，实现2种药材种子的分子鉴定，为白术种子质量标准制定提供参考。

1 材料

白术种子于2011年购自于河北安国药市及2012年采自湖南长沙，苍术于2011年采集自河南、湖北、山西、河北、山东等地，材料来源及鉴定人见表 1，凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心。

2 方法

2.1 DNA 提取

将干燥种子研磨成粉，取约0.01 g粉末置于2.0 mL的微量离心管中，加入900 μL已灭菌的CTAB提取液（2% CTAB，100 mmol·L-1 Tris-HCl，20 mmol·L-1 EDTA，1.4 mol·L-1 NaCl），0.01 g PVP 40000，10 μL β-巯基乙醇充分振荡混匀，65 ℃水浴1.0～1.5 h，期间轻摇2～3次。水浴结束后取出，冷却至室温，加入900 μL酚-氯仿-异戊醇（25∶24∶1），充分振荡混匀，12 000 ×g 离心10 min。取上清，加入等体积氯仿-异戊醇（24∶1），充分振荡混匀，12 000 ×g 离心10 min。取上清，加入2/3体积预冷的异丙醇溶液，-20 ℃放置0.5 h以上。取出，12 000 ×g 离心10 min，弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤2次，37 ℃挥干乙醇，用适量灭菌水溶解，-20 ℃保存。

2.2 引物设计

选择通用引物 psb A-trnH对白术、苍术样品进行PCR扩增并测序，获得BZ1～BZ10，MCZ1～MCZ10，BCZ1～BCZ20等40条序列；并于搜索

表1 试验材料

Table 1 Plant samples

GenBank数据库中苍术属 Atractylodes 的DNA序列信息，获得2条 A. lancea 的 psb A-trn H序列（GU724247.1；GQ435071.1），对所有白术、苍术序列进行多重比对，筛选获得SNP位点1个，为第175（A/T）位点，通过该位点设计白术鉴别引物，引物设定参照相关方法进行，并引入错配[11]。同时使用ITS通用引物作为质控引物用于评价样品DNA的质量，见表2。

表2 引物序列

Table 2 Primers in this paper

注：R1引物“-3′”端第二位“G”为错配碱基。

2.3 PCR扩增

2.3.1 通用引物 psb A-trn H和ITS2 PCR反应体系：扩增序列的通用反应体系：总体积25 μL，其中包括10×buffer缓冲液2.5 μL，dNTP 20 nmol，引物各2.5 pmol，r Taq 酶1 U，BSA 0.5 μL，DNA 20 ng，灭菌蒸馏水17.8 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性4 min后，94 ℃变性30 s，55 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 1 min，35个循环后72 ℃延伸 8 min。获得PCR产物通过2.0%的琼脂糖凝胶电泳，并用EB染色观察。

2.3.2 特异性PCR引物F1，R1 PCR反应体系与反应程序同上，并考察不同退火温度（48.8，49.3，50.1，51.1，51.8，52.6，53.2，54.6，55.2，56.3，57.2，57.2 ℃）对特异性PCR扩增稳定性的影响。

2.4 多重PCR鉴定体系建立及优化

利用白术特异性引物F1，R1和通用引物ITS2F，ITS2R构建多重PCR体系，用于白术，苍术的分子鉴定。优化PCR反应体系，即在特异性PCR反应体系的基础上，分析dNTP，引物，DNA模板， Taq 以及BSA浓度对PCR反应效率的影响，筛选最适PCR鉴别条件。具体设计如下：dNTP浓度2.5，5，10，15，20，30 nmol·L-1； 引物浓度2.5，5，7.5，10，15，20 pmol·L-1； DNA模版浓度100，50，20，10， 5，2.5 ng·L-1； DNA聚合酶0.25，0.5，1，2，2.5，3 U； BSA0，1，1.5，2.5，3.5，5 μg·L-1；引物总浓度为20 pmol·L-1，特异性引物与通用引物浓度比9∶1，6∶1，4∶1，3∶1，2∶1，1∶1。

2.5 阳性和阴性对照制备

分别将白术和苍术 psb A序列连接到pMD19-T载体上，获得重组质粒AmpsbA-pMD19，AlpsbA-pMD19。分别以AmpsbA-pMD19，AlpsbA-pMD19质粒DNA作为阳性和阴性对照模板。

2.6 使用多重PCR鉴定体系进行鉴别

使用以上建立的鉴别体系，对白术、苍术各样品进行鉴别，同时用该体系鉴别白术、苍术的混合DNA样品，即将白术DNA按一定比例与苍术DNA混合，考察PCR检出白术的DNA混合比例限度，混合后总DNA质量浓度为20 mg·L-1，白术所占比例为1%，5%，10%，50%，90%，95%，99%。

3 结果分析

3.1 白术、苍术特异性PCR鉴别

由于在特异性PCR鉴别引物中，人为引入错配位点，因此首先需要考察退火温度对PCR反应效率的影响，筛选能获得白术特异扩增的退火温度。结果表明，特异性引物F1-R1在退火温度48.8～57.2 ℃条件下均能扩增出专一的白术特异性条带，其大小为172 bp，而在苍术样品中没有检测到扩增产物。

3.2 白术多重PCR鉴别体系

本研究使用白术特异性引物作为鉴别引物、ITS通用引物作为质控引物构建多重PCR体系，并对多重PCR体系进行了优化。结果表明，DNA模板浓度在2.5～100 ng·L-1均能获得PCR扩增条带，且20 ng·L-1浓度的扩增效果较好；引物浓度5～20 pmol·L-1均能获得扩增，其中10 pmol·L-1较好；特异性引物与通用引物浓度比为4∶1，即F1，R1为8 pmol·L-1，ITS2F，ITS2R为2 pmol·L-1时质控条带和鉴别条带最清晰； Taq 酶0.15 U，35个扩增循环，dNTP浓度为10 nmol·L-1能获得最佳扩增效果。

3.3 白术、苍术样品及混合品分子鉴别

使用上述建立的位点特异性PCR鉴别体系对各地采集的白术、苍术样品进行鉴别，结果表明茅苍术、北苍术均能扩增获得643 bp的质控条带，而白术样品可同时获得质控条带和172 bp的白术鉴别条带，从而实现白术与苍术的分子鉴别。且Am psb A-pMD19质粒DNA作为模板，也可获得白术鉴别条带，而Al psb A-pMD19质粒DNA作为模板不能获得条带。由于实际生产中可能出现白术、苍术种子混杂的情况，为了有效鉴别混杂品，本研究利用位点特异性PCR鉴别体系对白术、苍术DNA混合样品进行检测。结果表明，白术样品DNA在混合品中所占质量比为10%时能检测出白术特异的鉴别条带，且随着所占质量比增加，条带丰度增加，见图1。

1～4.苍术；5～8.白术；9～15.不同比例白术、苍术DNA混合样品（白术所占比例依次为1%，5%，10%，50%，90%，95%，99%）。

图1 白术多重PCR鉴定

Fig.1 Multiplex PCR identification of Atractylodes macrocephala

4 小结

中药分子鉴别技术在中药材真伪鉴别中已经得到了良好的应用[12-14]，位点特异性PCR方法的建立将使药材种子真实性鉴别手段更加方便快捷，能很好的满足生产和质检要求。本研究使用生物技术手段对白术种子的真伪来源进行鉴别，建立了简便快捷的鉴别方法，可作为传统形态鉴别的补充，具有较强的推广价值，有利于白术药材种子质量标准的建立。

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Authenticate of Atractylodes macrocephala seed by

amplification refractory mutation system

CAO Liang1，2， JIANG Chao， PENG Hua-sheng， CHEN Min， YUAN Yuan（1.National Resource Center for Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medicinal Sciences， Beijing 100700， China；

2. Institute of Agricultural and Biology Resource Utilization， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， China；

3. Anhui College of Traditional Chinese Medicine Chinese， Hefei 230038， China）

[Abstract] Objective： To design specific primers and authenticate Atractylodes macrocephala from Atractylodes lancea and A. chinensis . Method： SNPs in the psb A-trnH sequences of Atractylodes were found by ClustulW program and Bioedit software. Primers for authentic A. macrocephala is designed according to the SNP site， and ITS sequence universal primers plus to the authentic primer to construct a multi-PCR reaction system， and then optimized the PCR reaction system. Result： 172 bp band special for A. macrocephala were found using multi-PCR reaction. Conclusion： The multi-PCR reaction system could be applied to identify A.macrocephala seed.

[Key words] Atractylodes macrocephala ； SNP； molecular identification； seed

doi：10.4268/cjcmm20131604