中国水仙居群遗传多样性的ISSR分析

摘 要 本实验利用ISSR分子标记技术研究5个中国水仙（Narcissus tazetta var. chinensis Boem&Chen）居群的遗传多样性。从40个随机引物中筛选出8个有效引物，共扩增出69个可分析位点，其中多态位点65个，多态性条带比率（PPL）为94.20%。实验表明基因分化系数（Gst）平均值为0.0622，居群间的基因流（Nm）为7.5378，上述结果表明中国水仙居群的遗传变异大部分存在于居群内部，5个居群间的基因交流很高，种群间的分化很少。

关键词 中国水仙 居群 ISSR 遗传多样性

中图分类号：S688 文献标识码：A

ISSR Analysis on Chinese Narcissus Group Genetic Diversity

ZHENG Qinfang, WANG Saijiao, ZHOU Gaixiao, ZHENG Weihong

(College of Life and Environmental Sciences, Wenzhou University, Wenzhou, Zhejiang 325000)

Abstract In this study, study on ISSR markers of five Chinese narcissus (Narcissus that tazetta var chinensis, the Boem & Chen) population genetic diversity. The eight primers selected from 40 random primers amplified a total of 69 analyzed sites of polymorphic loci and 65, the percentage of polymorphic bands (PPL) is 94.20%. Experiments show that the average gene differentiation coefficient (Gst) was 0.0622, gene flow among populations (Nm) 7.5378, the above results show that Xianju group of Chinese water most of the genetic variation within populations, five genes among populations the exchange of high population differentiation.

Key words Chinese narcissus; droup; ISSR; genetic diversity

中国水仙（Narcissus tazetta var. chinensis Boem &Chen）为石蒜科（Amaryllidaceae）水仙属多花水仙的一个变种，主要分布在我国的福建、浙江、江苏和台湾、上海等地。中国水仙栽培历史悠久，但是由于中国水仙为三倍体，很难自然和人工杂交产生新品种，而且新品种培育困难，导致数百年来中国水仙品种稀少，少有创新，乃中国水仙一大遗憾。并且近年来中国水仙野生资源丧失严重。因此，很有必要对中国水仙的遗传多样性进行深入研究。

简单序列重复间区（inter-simple sequence repeat，ISSR）是目前常用的分子标记技术。ISSR是在SSR的3’端或5’端加锚1~4个嘌呤或嘧啶碱基，并以此作为引物，一般为16~18个碱基序列，对两侧具有反向排列SSR的一段DNA序列进行扩增。再根据谱带的有无及相对位置，来分析不同样品间的多态性。这种分子标记方法具有简便、耗资少、模板DNA用量少、多态性高等优点，已广泛用于生物品种和居群间的遗传多样性研究。

1 材料和方法

1.1 植物材料

实验材料中国水仙的采集均利用植物遗传多样性的策略进行。每个居群采取20~30个体的叶片，分别装袋，硅胶干燥，并置于-70℃超低温冰箱中保存、备用。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取

采用Biospin植物基因组DNA试剂盒法提取，具体操作步骤参照厂家说明。每个居群20个样本，共提取100个DNA基因组。

1.2.2 PCR扩增

在预备实验中，对40个ISSR引物进行筛选，各选出8个能扩增出条带清晰且具多态性带型的引物。根据PCR正交试验设计，选取最佳组合的反应浓度。25 L ISSR-PCR体系中，dNTP的浓度200 mol・L-1，引物浓度1.6 mol・L-1，Mg2+浓度2.0mmol・L-1，TaqDNA 聚合酶1.5U，模板DNA浓度为9 ng/ L。

ISSR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，52~60℃退火1min，72℃延伸1min30s，进行40个循环，最后72℃继续延伸7min。

PCR反应产物经含有NA-red染料（2000：1）的1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，最后用凝胶成像系统（UVP）记录实验结果。

图1 引物ISSR-824扩增的ISSR带型

1.2.3 数据分析

将记录的图谱于Labworks 4.6软件中进行分析。同一引物在相同位点，根据条带的有（1）无（0）得到二元资料，形成0，1矩阵；在POPGENE32软件中进行分析，计算出样品间的Nei’ s相似性系数，并构建五个种群的系统树。

2 结果与分析

2.1 ISSR-PCR扩增

8个ISSR引物共扩增得到4886条谱带，检测到的清晰而且可重复的有效位点为69个，其中多态性条带65个，占总带数的94.20%；如图1所示为issr-824引物对5个居群水仙的扩增结果。每个引物扩增出的DN段为7~10个，平均8.62个；各位点的DN段长度集中在200~2000 bp之间。

2. 2 5个居群水仙的聚类分析

图2 基于中国水仙种群间Nei’s无偏差遗传距离构建的UPGMA 聚类图

利用 POPGENE32软件计算中国水仙种群间的Nei’s无偏差遗传距离（D）和遗传一致度（I）。ISSR标记中，五个中国水仙种群间的Nei’s 无偏差遗传距离在0.0229~0.0583之间（表1）。最后根据Nei’s遗传一致度和遗传距离，形成一个树型的UPGMA聚类图（图2）。

从图2可以看出在ISSR标记中，南麂一区和南麂二区两种群之间遗传距离最小（D = 0.0229），两者之间的遗传相似系数最大（I = 0.9774），首先聚为一类；接着是上海崇明和舟山普陀；最后和福建平潭聚在一起。以上聚类图进一步揭示了水仙居群的分化趋势和亲缘关系。其中最高遗传相似系数（I = 0.9774）与最低遗传相似系数（I = 0.9434）相差仅0.0340，这表明5个种群之间有着较高的相似性，遗传背景较为接近。

表1 中国水仙种群间的 Nei’s无偏差遗传距离（对角线以下）及遗传相似系数

3 讨论

实验结果显示，5个中国水仙居群，共100个样品基因组有较丰富的多态性。本文也得出中国水仙种群间有着较高的相似性，其遗传背景也较为接近，这与陈林姣、吴菁华等人所揭示的水仙品种亲缘关系较为密切，遗传背景基本一致的结论相同。根据各居群的Nei’s遗传距离所绘制的UPGMA树状聚类图可得出，各居群的地理位置对遗传距离有一定的影响作用。南麂一区和南麂二区的距离最近，首先聚为一类；上海崇明和舟山普陀的距离次之，聚为第二类；最后和地理位置最远的福建平潭聚在一起。地理较近的居群聚在一起，表现出比较明显的地域性，说明各居群的亲缘关系与地理分布有着密切的关系。